综述：纳米抗体在细菌和毒素检测中的免疫分析和免疫传感平台的分析性能：一项系统综述

《Antibodies》：Analytical Performance of Nanobody-Based Immunoassay and Immunosensing Platforms for Bacteria and Toxin Detection: A Systematic Review Aya Jalil, Nadia Touil, Omar Nyabi, Elmostafa El Fahime, Sara Benlhachemi, Jean-Luc Gala, Khalid Ennibi, Karim Bakkouri, Abdelaziz Benjouad and Lamiae Belayachi

本系统综述评估了基于纳米抗体（sdAbs/VHHs）的免疫分析和传感平台在检测细菌及其毒素方面的分析性能。通过对比传统方法，文章总结指出纳米抗体凭借其小尺寸、高稳定性、易于生产和工程化改造等优势，在多种平台（如ELISA、LFIA、电化学传感器等）中展现出高灵敏度、高特异性（如LOD可达103CFU/mL）和快速检测潜力。然而，当前研究大多依赖加标样本，缺乏大规模验证和天然污染样本的测试，未来需标准化评估和实际应用验证。

背景与引言

细菌病原体及其产生的毒素每年导致全球超过6亿例疾病，并加剧了抗菌素耐药性（AMR）问题。传统检测方法如平板培养、聚合酶链式反应（PCR）和免疫学分析，虽有效但存在耗时长、操作复杂等局限。免疫分析方法利用抗体与抗原的特异性结合进行检测，其中酶联免疫吸附试验（ELISA）是应用最广的技术之一。近年来，生物传感技术发展迅速，其核心是将生物识别元件与物理化学换能器结合。免疫传感器是其中一大类，它依赖于抗原-抗体反应。与传统抗体相比，单克隆抗体（mAbs）的生产过程复杂、耗时且涉及伦理问题。纳米抗体（Nanobodies^?，即VHH）是从骆驼科动物重链抗体中衍生的单域抗体片段，因其尺寸小、稳定性高、易于生产及工程化改造，为开发快速、高选择性、可靠的检测平台提供了有前景的替代方案。

材料与方法

本研究遵循PRISMA指南，对截至2025年8月初的文献进行了系统检索。研究问题围绕纳米抗体免疫分析在不同检测平台（如ELISA、侧向流动、电化学等）中对细菌和毒素检测的灵敏度、特异性及实用性展开。通过PICO框架确定纳入标准，最终筛选出32项符合条件的研究（2011-2025年）。数据提取涵盖了目标病原体/毒素、检测平台、检测限（LOD）、灵敏度、特异性、基质回收率等指标。使用经过调整的QUADAS-2工具评估偏倚风险。

结果

3.1 研究筛选结果

从1335条初始记录中，经过筛选，最终有32项研究被纳入本系统综述。

3.2 纳入研究的特征

在32项研究中，19项（59.37%）专注于细菌检测，13项（40.62%）专注于毒素检测。研究的目标包括沙门氏菌（多种血清型）、金黄色葡萄球菌肠毒素（SEA, SEB, SEC）、产志贺毒素大肠杆菌（E. coli O157:H7）、艰难梭菌毒素和单核细胞增生李斯特菌等。大多数VHH来源于免疫的骆驼科动物文库，但也有研究使用天然或合成文库，这表明正在向无动物生产过渡。检测平台以ELISA为主，侧向流动免疫层析（LFIA）探索较少，而电化学生物传感器、纳米酶或光热/荧光方法则代表性不足。分析性能差异显著，噬菌体介导的化学发光ELISA（P-CLISA）和双模式比色/光热分析等平台，与传统ELISA相比，检测灵敏度提高了10至100倍。特异性普遍较高，但由于抗原相似性，也存在交叉反应（如鼠伤寒沙门氏菌与副伤寒沙门氏菌）。

3.3 纳入研究的方法学质量

使用QUADAS-2工具进行评估。在样本选择方面，几乎所有研究都依赖加标的食品和粪便基质，而非自然污染的样本，这导致偏倚风险和应用性问题的风险为中度。在指标测试（即纳米抗体分析）方面，由于方案描述清晰、阈值预先设定，偏倚风险普遍较低。在参考标准方面，大多数研究使用培养、PCR或商业ELISA作为比较方法，偏倚风险较低。在流程和时序方面，大多数研究在样本制备后立即处理，偏倚风险较低，但也有少数研究因缺少排除样本的细节而存在高风险。总体而言，纳米抗体免疫分析在技术上稳健，但由于主要依赖加标样本，其在现实世界中的广泛应用性仍然有限。

讨论

4.1 纳米抗体平台的技术特点

VHH的主要优势在于其重组特性，便于基因工程和灵活的检测设计。缺乏Fc区减少了复杂基质中的非特异性结合，从而提高了特异性。例如，针对SEC的VHH-ELISA显示出高特异性，对相关肠毒素（SEA, SEB）、金黄色葡萄球菌蛋白A（SpA）或全菌株几乎没有交叉反应性。功能工程扩展了纳米抗体在各种平台上的应用，从酶融合到纳米颗粒结合。例如，将VHH与辣根过氧化物酶（HRP）融合，或与金纳米颗粒（AuNP）结合，可提高检测灵敏度。这些策略结合高产量的大肠杆菌表达系统，突显了低成本、可扩展的生产潜力。

4.2 分析性能与现场适用性

基于纳米抗体的检测通常可实现更短的检测时间，这主要归因于改善的抗原捕获动力学、更高的功能表面密度以及与传统抗体形式相比更强的稳定性。几项检测在15分钟内完成检测，并增强了稳定性。例如，金/链霉亲和素-生物素纳米抗体侧向流动免疫分析法（Au/SA@Bio-Nb-LFIA）可在牛奶、果汁和猪肉中检测鼠伤寒沙门氏菌，LOD为10³–10⁴CFU·mL^?1。光热KNb-DITS生物传感器可在20分钟内识别鼠伤寒沙门氏菌。Zhang等人（2022年）开发的P-CLISA检测鼠伤寒沙门氏菌，与传统的双纳米抗体ELISA相比，噬菌体介导的信号放大使灵敏度提高了约100倍，LOD达到3.63 × 10³CFU/mL。在毒素检测方面，Lv等人（2025年）建立了两种ELISA方法和一种时间分辨荧光免疫层析法（TRFICA）用于检测肉毒杆菌神经毒素（BoNT/A和BoNT/B），临床样本检测灵敏度高达98%，特异性为96.7%。TRFICA方法仅需15分钟。成本效益和可扩展性是主要优势。大肠杆菌表达系统因其低成本、短发酵周期和高重组产量而被广泛使用。平台设计也进一步影响了可负担性，例如“RANbody”夹心ELISA通过兼具识别和催化能力的双纳米抗体，消除了对二抗的需求，从而降低了成本和时间。多重检测代表了另一项创新，例如用于同时检测多种沙门氏菌血清群的双信号放大LFIA（D-LFIA）平台。

4.3 与传统抗体免疫分析的比较视角

纳米抗体免疫分析与传统抗体形式的比较是通过概念性、间接和并行基准测试方法进行的，而非严格的头对头评估。多项研究明确指出VHH的优势，特别是在复杂基质中减少Fc介导的非特异性结合。间接比较也很常见，例如将纳米抗体ELISA与先前报道的mAb/pAb ELISA进行基准测试，强调更广的血清型覆盖范围和更低的检测复杂性。纳米抗体平台还与商业试剂盒或金标准诊断方法进行了比较，显示出相当或更高的灵敏度。然而，由于大多数比较是间接的，或是对标商业试剂盒而非在相同条件下构建的IgG对照，因此将性能提升明确归因于纳米抗体本身的内在特性仍然有限。未来的研究需要纳入更严格的头对头基准测试。

4.4 主要发现

基于纳米抗体的免疫分析在检测细菌和毒素（尤其是食源性感染）方面表现出持续强劲的分析性能。夹心ELISA是最常用的平台，其次是LFIA、电化学传感器和双模式检测（比色/荧光或光热/ELISA），这些平台提高了检测灵敏度。检测限（LOD）从毒素的皮克水平到细菌的10³–10⁵CFU/mL不等，对于更低浓度通常需要富集步骤。特异性普遍很高，这主要归因于避免了传统抗体中常见的Fc介导的交叉反应。在加标基质中的回收率在70–110%之间，变异系数低于15%，证实了检测的精确性。VHH主要来源于免疫的骆驼科动物（美洲驼、羊驼），但天然和合成文库也被证明有效。

4.5 局限性

尽管性能前景看好，但也存在一些局限性。几乎所有的研究都使用加标样本而非自然污染的样本，这限制了其真实世界的适用性和有效性。部分研究未包含比较参考方法（如培养、PCR或商业ELISA），引发了对诊断基准测试的担忧。此外，在许多研究中，纳米抗体平台未在相同条件下与基于IgG的对应物进行直接基准测试，限制了关于其比较性分析优势的明确结论。除了检测水平的验证，对纳米抗体试剂质量的关注有限。大多数研究中，纳米抗体的功能是从最终免疫分析格式中成功的信号生成推断出来的，而很少报告对生产的纳米抗体试剂的独立确认。灵敏度报告也有限；只有两项研究提供了明确的灵敏度值。此外，验证主要局限于受控的实验室条件和小样本量；很少有研究评估长期稳定性、批次间重复性或现场水平的稳健性。

4.6 研究空白

未来的研究应解决几个明显的空白。迫切需要使用各种基质（包括食品和临床诊断）中的自然污染样本进行验证，以确认其在实验室环境之外的适用性。应系统报告分析性能指标（灵敏度、特异性）以支持可比性和荟萃分析。缺乏与金标准诊断方法和商业试剂盒的比较研究，这对于监管和行业应用至关重要。此外，多重检测分析尽管在食品和临床环境中具有高度相关性，但仍开发不足。最后，成本效益、大规模生产以及集成到即时检测或现场可部署设备中，是决定实际应用但尚未充分探索的领域。

结论

据我们所知，这是第一篇专注于基于纳米抗体的免疫分析检测细菌病原体和蛋白质毒素的系统综述。对32项研究的分析突显了VHH作为重组识别元件在工程上的灵活性，使其能够集成到多种生物传感平台中。所报道的特异性和操作稳健性的提升，主要与检测结构和平台设计相关，而非VHH固有的物理化学优越性。重要的是，试剂水平的质量控制（特别是单分散性评估）很少被报告，这限制了对检测重复性的信心。大多数研究依赖加标样本，且与商业或金标准方法的基准测试有限，这强调了对标准化验证、严格的比较研究以及在自然污染或临床样本中进行测试的需求，以支持其转化应用。