《Frontiers in Plant Science》：Selection and characterization of salt-tolerant plant growth promoting bacteria associated with the endosphere and rhizosphere of perennial glasswort from the Apulia Region (Italy)
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本文综述了从盐渍化农业可持续生产需求出发，在意大利普利亚Margherita di Savoia地区的盐沼环境中，以多年生海蓬子（Arthrocaulon macrostachyum）为研究对象，系统性地从其根际和内生环境分离、筛选并表征了耐盐植物促生细菌（PGPB）。研究通过功能筛选、RAPD-PCR分型及主成分分析（PCA），鉴定出三株（Pseudomonassp. 105S, Bacillus safensis80S, Peribacillus frigotolerans114S）具有互补促生特性的高耐盐（>10% NaCl）候选菌株，为开发针对盐胁迫环境的微生物菌剂（Biofertilizer）提供了宝贵的核心种质资源。
引言
全球人口增长对农业可持续性构成重大挑战，预计到2050年粮食需求将增加70%。然而，土壤盐渍化问题日益严重，全球超过20%的耕地已受盐分影响，导致大面积土地不适宜传统农业。这迫使人们寻求创新方法以利用盐碱地等边际环境。植物根际（Rhizosphere）及其亚区室（根表和内生区）是微生物多样性最丰富的区域，其中栖息着多种植物促生细菌（PGPB）。PGPB在溶解土壤必需养分（如磷、铁、钾）、协助植物抵抗病原体、提高作物产量方面起着关键作用，并显示出替代化肥的潜力。在盐生植物中，多年生海蓬子广泛分布于沿海高盐区域，是研究耐盐微生物相互作用的理想模型。本研究旨在从意大利普利亚Margherita di Savoia盐沼的两个地点采集的多年生海蓬子中，分离、表征并筛选耐盐的潜在PGPB。
材料与方法
样本采集与处理
微生物采样于2023年春季在Margherita di Savoia的两个地点（S1和S2）进行，各点设三次重复。采集了包括周围土壤和完整根系在内的样本。在实验室中，从每株植物上获取了三种样本类型以针对不同微生物区室：大块土壤、与根际相关的根段以及植物内部组织（内生区）。
土壤宏基因组分析
对每个采样点的土壤样本进行鸟枪法宏基因组测序。使用DNeasy PowerSoil Pro Kit提取DNA，通过Illumina NovaSeq平台进行测序。原始数据经fastP质控过滤后，使用Kraken2进行物种分类，并通过Bracken进行物种丰度定量。
内生与根际微生物的分离
内生菌分离采用表面灭菌法处理植物组织，研磨后悬浮，涂布于营养琼脂（NA）平板。根际微生物分离是将紧贴根表的土壤颗粒悬浮于生理盐水，经系列稀释后，涂布于不同的选择性培养基，以分离中温细菌、Pseudomonasspp.、产孢细菌、放线菌和固氮细菌。从所有平板中挑选形态不同的菌落进行纯化保存。
表征测试
所有分离株（根际菌和内生菌）均通过革兰氏染色、过氧化氢酶、氧化酶、脲酶试验、显微镜观察等进行形态和生化表征。为评估植物促生特性，测试了分离株在溶解磷酸盐和硅、产生吲哚乙酸（IAA）和铁载体、产氨、耐干旱和高盐等方面的能力。具体方法包括：在Pikovsky培养基上检测磷酸盐溶解（形成透明圈）；在含硅酸盐的特定培养基上检测硅溶解；在添加色氨酸的YEM培养基中通过Salkowski’s试剂反应检测IAA产生；通过CAS（铬天青S）蓝琼脂覆盖法检测铁载体产生（蓝变黄/橙）；在含蛋白胨水的培养基中通过Nessler’s试剂反应检测氨产生；通过在NA中添加不同浓度NaCl（5%-17.5% w/v）评估耐盐性；通过在TSB中添加不同浓度PEG6000评估耐旱性。
分离株鉴定与统计分析
首先通过随机扩增多态性DNA聚合酶链式反应（RAPD-PCR）对分离株进行菌株水平分型，并使用GelJ v.2软件构建基于相似性矩阵的UPGMA树状图。基于RAPD分型和功能特性，筛选出最有潜力的三株候选菌，通过扩增其16S rRNA全长区域并进行测序，在GenBank的BLAST数据库中进行物种鉴定，并获得登录号（PX363210, PX363286, PX363300）。将定性表征结果（产氨、磷酸盐/硅溶解、IAA产生、铁载体产生）转换为数值代码（0/1），作为输入值进行主成分分析（PCA），以评估分离株的功能特征分布。
结果
微生物群落结构与分离株概况
土壤宏基因组分析显示，微生物群落以细菌域为主导（92%），其次是真核域（5%）和古菌域（3%）。细菌域中，放线菌门（Actinomycetota）和假单胞菌门（Pseudomonadota）占主导，分别占总细菌多样性的50%和36%。在可培养微生物方面，通过选择性培养基分离得到110株细菌（100株根际菌，10株内生菌）。中温菌和产孢菌的密度最高，其次是放线菌、假单胞菌和固氮菌。内生菌群浓度较低。
植物促生功能性状分布
功能筛选结果显示，分离株表现出多样化的PGPB特性：
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磷酸盐溶解：18株（16%）具有此能力，其中假单胞菌科阳性率最高（58%），而内生菌均无此能力。
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硅溶解：25株（23%）具有此能力，假单胞菌科再次表现出最高阳性率（75%）。
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产氨：13株（12%）呈阳性，在放线菌和产孢菌中比例相对较高。
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吲哚乙酸（IAA）产生：20株（18%）呈阳性，假单胞菌科阳性率最高（50%）。
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铁载体产生：34株（31%）呈阳性，以内生菌阳性率最高（63%）。
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耐盐性：50株（45%）能在>10% NaCl浓度下生长。其中，33株耐受>15% NaCl，28株耐受高达17.5% NaCl。所有内生菌均表现出耐盐性，其次是产孢菌（59%）。
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耐旱性：特定根际菌分离株在缺水条件下仍能保持生长。
候选菌株筛选与鉴定
对耐盐（>10% NaCl）分离株进行主成分分析（PCA），前两个主成分累计解释了65.83%的方差。根据PCA结果和PGPB功能互补性，筛选出三株最有前景的候选菌：
- 1.
Pseudomonassp. (105S)：具有磷酸盐溶解、硅溶解、耐盐、耐旱和产铁载体能力。
- 2.
Bacillus safensis(80S)：具有产氨、耐盐、产IAA、耐旱和产铁载体能力。
- 3.
Peribacillus frigotolerans(114S)：具有最广泛的PGPB活性，对磷酸盐溶解、硅溶解、耐盐、产IAA、耐旱和产铁载体均呈阳性，仅产氨为阴性。
讨论
本研究揭示的以放线菌门和假单胞菌门为主的微生物群落结构，与其他盐渍环境中的报道一致。分离株以革兰氏阳性产孢菌和革兰氏阴性假单胞菌为主，符合盐渍环境的常见模式。功能分析表明，海蓬子是与多功能耐盐PGPB相关的重要资源库。硅溶解能力的发现具有重要意义，因为硅有助于增强植物对非生物胁迫（特别是盐度）的防御。IAA产生菌株数量有限，但该特性对根系发育和胁迫适应具有战略价值。高达45%的分离株（特别是所有内生菌）表现出高耐盐性，其中28株耐受高达17.5%的盐浓度，表明存在高度特化的耐盐机制。
通过PCA进行多变量统计分析，能够有效处理多性状数据的复杂性，并筛选出具有互补功能的菌株。所选的三株菌（Pseudomonassp., B. safensis, P. frigotolerans）均属于公认具有PGPB能力和环境适应性的属，与近期其他关于盐生植物相关PGPB的研究结果相互印证。Pseudomonas以其代谢灵活性和多种促生机制著称；Bacillus在环境持久性和制剂稳定性方面具有优势；P. frigotolerans则因其产生生物活性化合物和通过多种途径增强植物抗逆性的能力而受到关注。
然而，本研究也存在局限性：所有PGPB性状均在受控实验室条件下评估，其在复杂田间条件下的表达和效果可能不同；采样局限于单一地理区域和季节，限制了观察模式的普适性。因此，所选菌株应被视为需要后续验证的候选者。
结论
本研究成功从地中海沿海生态系统的多年生海蓬子中分离、表征并筛选出耐盐细菌。通过系统筛选和多元分析，选出了三株具有互补PGPB特性（包括磷酸盐和硅溶解、IAA产生、铁载体合成、耐盐（>10% NaCl）和耐旱）的候选菌株（Bacillus safensis80S, Pseudomonassp. 105S, Peribacillus frigotolerans114S）。
这项工作代表了基础表征阶段。实验室性状评估虽有必要，但无法完全预测其在真实植物-土壤条件下的表现。这些菌株作为盐渍农业有效生物肥料的价值，最终需要通过植物接种实验进行验证。未来的研究方向包括：全基因组测序以鉴定耐盐和PGPB活性的遗传决定因子；与本地土壤微生物组的兼容性研究；扩大时空尺度的采样并结合功能宏基因组学，以捕获沿海盐生植物生态系统中更广泛的PGPB多样性；以及通过整合宏基因组学、宏转录组学和代谢组学等方法，跨植物区室进行比较微生物组分析，以阐明微生物空间组织如何贡献于盐生植物的耐盐策略。
