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本研究通过整合生物信息学分析与体内实验，系统揭示了中性粒细胞胞外陷阱（NETs）相关基因在脊髓损伤（SCI）中的关键作用。文章筛选出FCGR1A、CLEC6A、RETN等候选枢纽基因，并在独立数据集与动物模型中验证了FCGR1A的上调及其与免疫细胞（如活化肥大细胞、初始CD4+T细胞）的相关性。功能富集分析表明差异表达NETs相关基因（DE-NRGs）显著富集于NET形成通路等免疫炎症过程。该工作为理解NETs在SCI病理机制中的角色提供了新线索，并提示FCGR1A或作为NET相关的潜在生物标志物。
引言
脊髓损伤（SCI）是一种导致严重运动、感觉和自主神经功能障碍的毁灭性神经系统疾病，其发病率全球范围内持续上升，给患者和医疗系统带来沉重负担。尽管临床管理有所进步，但能够阻止疾病进展或逆转神经缺损的有效策略仍十分有限。继发性损伤过程，尤其是神经炎症，在SCI病理进展中扮演核心角色。其中，中性粒细胞浸润及其活化是加剧继发性损伤的关键因素。近年研究发现，活化的中性粒细胞可通过释放中性粒细胞胞外陷阱（NETs）——一种由胞外DNA和颗粒蛋白组成的网状结构，驱动炎症并加重组织损伤。越来越多的证据表明NETs相关基因（NRGs）在多种炎症与免疫介导疾病中发挥作用，但它们在SCI中的全面作用图谱仍不清楚。因此，本研究旨在系统刻画SCI中NET相关基因特征，并探索其在疾病病理生理学中的潜在作用。
材料与方法
研究从基因表达综合库（GEO）获取了GSE151371数据集（包含38例SCI患者和10例健康对照的外周血RNA表达谱），并引入独立数据集GSE45006（大鼠模型，包含假手术对照与损伤后不同时间点的SCI样本）用于验证。通过差异表达分析、加权基因共表达网络分析（WGCNA）筛选与SCI相关的基因模块和差异表达基因（DEGs），并将其与从文献中获取的231个NETs相关基因（NRGs）列表取交集，得到10个差异表达的NETs相关基因（DE-NRGs）。随后应用八种机器学习算法（包括LASSO、随机森林、支持向量机等）对候选基因进行优先级排序，以确定枢纽基因。利用CIBERSORT算法基于预定义的白细胞基因特征矩阵估算外周血样本中的免疫细胞组成，并分析枢纽基因表达与免疫细胞比例的相关性。此外，通过基因集富集分析（GSEA）探索与枢纽基因表达相关的通路，并构建蛋白-药物互作网络及调控网络（整合转录因子和微RNA）。最后，在大鼠SCI模型中通过实时定量PCR（RT-qPCR）和免疫荧光对枢纽基因的表达进行体内验证。
结果
WGCNA识别与SCI相关的基因模块
对GSE151371数据集进行WGCNA分析，识别出四个基因共表达模块。其中，绿松石模块与SCI呈现最强的正相关性（相关系数=0.86, P=9×10-15），该模块内的591个基因被保留用于后续分析。基因显著性（GS）与模块成员（MM）之间存在强正相关，表明该模块内高度连接的基因与SCI关联更密切。
SCI中NETs相关差异表达基因的表达模式
差异表达分析共识别出1138个DEGs（707个上调，431个下调）。将DEGs、绿松石模块基因与预定义的NRGs取交集后，得到10个DE-NRGs。表达相关性分析显示，这些DE-NRGs之间存在显著的协调表达模式，例如ELANE与MPO呈现最强的正相关（r=0.908），而CD177与PIK3R3之间存在明显的负相关（r=-0.526）。
DE-NRGs的GO与KEGG富集分析
基因本体（GO）富集分析表明，DE-NRGs显著富集于髓系细胞、中性粒细胞介导的免疫反应、颗粒组织等免疫相关生物过程。京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析进一步显示，DE-NRGs显著富集于“中性粒细胞胞外陷阱形成”通路。
基于机器学习优先筛选介导NETs-SCI交互作用的关键基因
应用八种机器学习算法对10个DE-NRGs进行特征选择与优先级排序。交集分析确定了三个共识基因：CLEC6A、FCGR1A和RETN。随后在独立数据集GSE45006中进行验证，发现仅FCGR1A表现出显著的差异表达，从而确认了其与SCI的关联。这表明FCGR1A可能作为NETs参与SCI发病机制的一个关联标志物。
CIBERSORT估算的免疫细胞组成分析
与健康对照相比，SCI样本表现出改变的免疫细胞组成谱，其特征是活化的NK细胞、单核细胞、活化肥大细胞和中性粒细胞的比例估计值增加，而CD8+T细胞、静息与活化的CD4+记忆T细胞、静息NK细胞和嗜酸性粒细胞的比例估计值降低。相关性分析显示，FCGR1A表达水平与活化肥大细胞、初始CD4+T细胞的估计丰度呈正相关，而与初始B细胞、静息记忆CD4+T细胞呈负相关。其中，初始CD4+T细胞与FCGR1A表达的相关性最强。
与FCGR1A表达相关的通路和功能注释
基于FCGR1A表达水平的分层通路关联分析显示，较高的FCGR1A表达与癌症相关通路（如宫颈癌、乳腺癌、白血病、多发性骨髓瘤）的基因集富集相关，这些基因集主要反映了共享的炎症、免疫和细胞增殖相关信号程序。相反，较低的FCGR1A表达与神经发育、干细胞相关程序以及免疫调节通路（包括T细胞功能和Notch1靶基因特征）的基因集富集相关。
分子调控网络与药物预测
构建了以枢纽基因FCGR1A为中心的蛋白-药物相互作用网络，以识别潜在的靶向治疗化合物。同时，通过生物信息学分析预测了上游的转录因子（TFs）和靶向微RNA（miRNAs），揭示了FCGR1A可能受一个涉及多个TFs和miRNAs的复杂网络调控。
FCGR1A的体内实验验证
为验证生物信息学发现，在大鼠SCI模型中检测了脊髓组织中FCGR1A的表达。实时定量PCR分析显示，与假手术组相比，SCI组中FCGR1A的mRNA表达显著上调。免疫荧光染色结果一致表明，SCI大鼠脊髓组织中的FCGR1A蛋白表达也显著升高。这为FCGR1A在SCI中作为上调的NETs相关基因提供了体内实验支持。
讨论
创伤性SCI的病理生理学涉及由机械创伤引起的即时原发性损伤，以及随后复杂且演变的继发性损伤级联反应，其中神经炎症成为核心致病特征。在SCI后的众多炎症反应中，NETs已成为加剧继发性损伤的重要因素。本研究通过整合多组学与机器学习框架，并辅以体内验证，旨在阐明参与SCI的关键NETs相关基因。WGCNA识别出一个与SCI显著相关的基因模块，差异表达分析揭示了大量在SCI中失调的基因，二者的交集与NETs相关基因列表进一步筛选出10个DE-NRGs。功能富集分析表明这些基因显著富集于中性粒细胞介导的免疫过程和NET形成通路，支持了其与NETs相关的生物学相关性。机器学习优先级排序确定了三个候选枢纽基因，但在独立数据集中仅FCGR1A展现出一致且显著的差异表达，支持了其在SCI背景下的稳健性。免疫细胞组成分析揭示了SCI中全身性免疫状态的改变及其与FCGR1A表达的相关性，特别是在外周血中，FCGR1A表达与初始CD4+T细胞比例估计值的相关性最强。然而，需要注意的是，外周免疫谱可能无法完全捕获损伤部位脊髓内的复杂细胞环境。通路关联分析表明FCGR1A表达与富含炎症、免疫和增殖相关信号的癌症通路基因集存在关联，但这描述的是通路层面的相关性，而非因果关系。FCGR1A基因的蛋白产物是CD64（FcγRI），一种对免疫球蛋白G（IgG）具有高亲和力的Fc受体，主要表达于髓系细胞，是免疫效应功能的重要介质。在巨噬细胞中，CD64表达在经典活化（M1）表型中优先增加，使其成为慢性炎症环境中促炎巨噬细胞极化的公认标志物。本研究的体内实验证实了SCI后脊髓组织中FCGR1A表达的上调，支持了其与SCI中NETs相关炎症特征的关联，提示FCGR1A可能作为SCI中潜在的NETs相关生物标志物。然而，FCGR1A在NET形成和SCI病理生理学中的具体功能作用和分子机制仍有待充分阐明。
结论
本研究通过整合生物信息学分析和体内表达验证，确定FCGR1A为SCI中与NETs相关炎症特征相关的上调基因。虽然FCGR1A在分析的基因网络中被强调为一个持续失调的候选基因，但本研究结果并未确立该基因在SCI中的因果或功能作用。相反，我们的研究结果提供了一个假设生成的框架，可为未来旨在阐明FCGR1A和NETs相关免疫过程在SCI中的机制和功能相关性的实验研究提供信息。通过将转录组学分析与基于机器学习的优先级排序相结合，这项工作提供了一个数据驱动的资源，以指导后续的机制研究，而非关于疾病调控或治疗干预的确定性结论。
