《Frontiers in Microbiology》：Crop rotation-driven changes in secondary metabolites of potato rhizosphere soil exert stronger regulation on soil microbial community
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本研究通过分析马铃薯连作（P-P）、玉米-马铃薯（M-P）和豇豆-马铃薯（V-P）三种轮作模式下根际土壤代谢物与微生物群落变化，揭示了轮作通过降低防御性次生代谢物（如酚类、黄酮、生物碱、萜类）含量，同时富集有益微生物（如生防、固氮、碳循环等功能类群），进而提高土壤微生物多样性、优化群落结构，最终促进马铃薯生长与产量，为轮作在农业生产中的土壤微生态调控机制提供了新视角。
引言
轮作作为一种可持续耕作模式，在农业生产中日益普及。合理的轮作体系可通过前茬作物的遗留效应（legacy effect）对后茬作物的生长和产量产生积极影响。大量研究表明，轮作能够打破病原体和害虫的生命周期、改善土壤养分有效性、减少农业化学品需求，从而提升整体生产力和品质。轮作系统的这些积极效应越来越多地被证明主要由植物-土壤-微生物的地下互作过程驱动。然而，这些过程的潜在地下机制尚不清楚，限制了我们对轮作产量效益的理解。
土壤微生物通过多种机制介导耕作系统中的关键地下生态过程，包括加速土壤养分循环、增加植物可利用的土壤养分、合成植物促生物质、激发植物防御反应以及通过竞争或抗生作用直接抑制土壤病原体。因此，土壤微生物的多样性和群落组成与植物表现密切相关。许多研究证实，与连作相比，轮作会改变土壤微生物的丰度、多样性和组成。例如，一项对大豆、高粱、玉米和小麦等作物的122项研究进行的Meta分析显示，轮作多样性可使土壤微生物量增加20%以上，这主要归因于土壤养分循环的增强。
根际土壤代谢物主要来源于植物根系分泌物、根系凋落物和微生物代谢，也是驱动地下过程的关键因素，紧密连接着植物-土壤-微生物的互作。根际代谢库包含多种化学类别，如糖类、有机酸和次生代谢物。根际土壤中的防御性次生代谢物（如酚类化合物、萜类和生物碱）主要在生物或非生物胁迫下由植物或微生物产生，以缓解不利环境。这些化合物可作为化感物质，对植物产生直接抑制作用，或通过调节土壤环境条件和微生物群落结构（如病原体和共生体）来影响作物表现。
马铃薯（Solanum tuberosum）是全球第四大粮食作物，但连续马铃薯种植会带来一系列环境威胁，如土传病害、土壤肥力下降和生产力降低。轮作有可能通过改善土壤理化性质和酶活性、调节土壤微生物群落组成来缓解这些不利影响。然而，尽管已有研究记录了马铃薯轮作系统中微生物多样性和组成的变化，但根际代谢物变化在不同轮作系统中调节微生物群落组成的机制仍不清楚。
本研究选择了研究区域三种常见的马铃薯轮作模式，包括马铃薯连作（P-P）、玉米-马铃薯轮作（M-P）和豇豆-马铃薯轮作（V-P）。在马铃薯块茎膨大盛期采集根际土壤样品，分析了农艺性状、根际土壤代谢物和土壤微生物组的变化，揭示了不同马铃薯轮作系统间的关键差异代谢物和微生物类群及其相互作用。旨在检验不同马铃薯轮作系统中根际土壤代谢物变化对土壤微生物群落的调控作用。
材料与方法
本研究在中国山东省滕州市进行。试验设置了三种处理：马铃薯连作（P-P）、玉米-马铃薯轮作（M-P）和豇豆-马铃薯轮作（V-P）。每种轮作模式在三个面积为5.4 m × 12 m的小区进行。于2024年10月马铃薯块茎膨大盛期，在每个小区随机选择5株植物，小心挖出仍附着在植物上的完整根系，通过抖落的方式收集紧密粘附在根上的根际土壤。每个小区的土壤样品混合成一个复合样品，每种马铃薯种植模式有三个生物重复。
一部分根际土壤样品用于超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）分析和土壤微生物组的高通量测序。另一部分样品风干用于理化性质分析。测定了马铃薯成熟期的株高、茎粗、单株块茎数和产量。测定了土壤pH、有机质、全氮、全磷和有效磷含量。
使用甲醇提取根际土壤样品中的代谢物，然后进行液相色谱-质谱（LC-MS）分析。原始数据使用XCMS软件包进行处理，通过匹配HMDB、MassBank、KEGG、LipidMaps、mzCloud等数据库鉴定代谢物。使用OPLS-DA模型筛选组间差异代谢物（VIP值 ≥ 1且P值 ≤ 0.05）。
使用E.Z.N.A.? Soil DNA Kit提取根际土壤总DNA。使用338F/806R引物扩增细菌16S rRNA基因的V3-V4高变区，使用ITS1F/ITS2R引物扩增真菌ITS区。在Illumina MiSeq PE300平台上进行扩增子测序。使用UPARSE流程在97%相似性水平上将序列分配为操作分类单元（OTUs）。通过与Silva数据库（v138.1）和UNITE数据库（v9.0）比对，对代表性细菌和真菌序列进行从属到门的分类学归属。
对数据进行正态性和方差齐性检验。使用单因素方差分析（one-way ANOVA）比较马铃薯农艺性状、差异代谢物和主要微生物门相对丰度、α多样性及土壤理化因子的显著性差异，并使用Tukey检验进行均值比较。基于Bray-Curtis距离矩阵的相似性分析用于评估不同位点间根际土壤微生物和代谢物群落组成的差异，并使用非度量多维尺度（NMDS）排序图进行可视化。通过线性判别分析（LDA）筛选不同位点间潜在差异的土壤微生物类群。使用Pearson相关分析确定差异代谢物、土壤环境因子与根际土壤微生物多样性之间的关系。使用Mantel检验评估差异代谢物与根际土壤微生物群落组成之间的相关性。使用冗余分析（RDA）研究土壤环境因子与土壤微生物群落组成之间的关系。使用变异分配分析（VPA）确定根际土壤初级代谢物、次生代谢物和土壤因子对不同位点微生物群落组成变异的单独和共同解释率。此外，使用双向正交偏最小二乘回归（O2PLS）分析检验土壤微生物群落组成与次生代谢物之间的协变关系，关键驱动因子的识别基于变量投影重要性（VIP ≥ 1）。
结果
3.1 马铃薯农艺性状与根际土壤理化性质
P-P轮作中马铃薯的株高和单株块茎数显著低于轮作系统。马铃薯的茎粗和产量在P-P轮作中最低，在V-P轮作中最高。V-P轮作的根际土壤pH和有机质含量最高。M-P轮作的土壤全氮含量显著高于P-P和V-P轮作，而土壤全磷含量则呈相反趋势。土壤有效磷含量在P-P轮作中最高，在V-P轮作中最低。
3.2 马铃薯根际土壤代谢物谱
在马铃薯根际土壤中共鉴定出978种代谢物（包括初级、次生代谢物和外源物），其组成在连作和不同轮作系统之间存在显著差异。与P-P轮作相比，V-P轮作中初级代谢物（如碳水化合物及结合物、氨基酸和酯类）的水平分别增加了3.63倍、1.56倍和1.28倍。辅因子和维生素、脂质和嘌呤在P-P或M-P轮作中含量最高。
与防御机制相关的主要次生代谢物，如生物碱和其他含氮化合物、酚类及其他苯衍生物、黄酮类和萜类，在V-P轮作中相较于P-P轮作分别减少了1.32倍、2.33倍、1.40倍和2.17倍。然而，醌类在M-P轮作中更丰富。碳氢化合物以及类固醇和衍生物的含量在V-P轮作中显著高于P-P和M-P轮作。
3.3 马铃薯根际土壤微生物多样性
P-P、M-P和V-P轮作马铃薯根际土壤样品的细菌α多样性估计分别为1210、1546和1706个OTUs。V-P轮作的香农指数和Chao1指数最高，其次是M-P轮作。其他多样性指数在P-P轮作中最低，但M-P和V-P轮作之间无显著差异。
在马铃薯根际土壤中检测到的真菌OTUs数量在M-P（315个OTUs）和V-P（300个OTUs）轮作中显著高于P-P轮作（257个OTUs）。香农指数和Pielou指数在V-P轮作中最高，而Chao1指数和ACE指数在M-P轮作中最高。然而，所有这些多样性指数在V-P和M-P轮作之间均无显著差异。
3.4 马铃薯根际土壤微生物群落组成
马铃薯根际土壤中的细菌和真菌群落组成在轮作系统间存在显著差异。在排名前10的最丰富细菌门中，变形菌门、拟杆菌门、绿弯菌门、芽单胞菌门和粘球菌门在V-P轮作中最为丰富，在P-P轮作中最不丰富。Patescibacteria和厚壁菌门在M-P轮作中的相对丰度显著更高。然而，放线菌门和酸杆菌门在P-P轮作中更丰富。
在主要真菌门中，担子菌门的相对丰度在M-P轮作中显著更高。被孢霉门和壶菌门在P-P轮作中具有更高的相对丰度。Aphelidiomycota在V-P轮作中更丰富。子囊菌门和Rozellomycota的相对丰度在轮作系统间无显著差异。此外，Basidiobolomycota在V-P轮作中被检测到，而Monoblepharomycota在M-P和P-P轮作中被检测到。
线性判别分析确定了48个细菌和30个真菌群落，它们在轮作系统间具有显著的丰度差异。与P-P轮作相比，轮作系统中有益细菌类群更为丰富。V-P轮作的根际土壤富集了溶磷细菌家族假单胞菌科、氮循环细菌属根瘤菌属和假单胞菌属、碳循环细菌目伯克霍尔德氏菌目，以及污染物降解细菌目鞘脂单胞菌目。与营养循环相关的细菌属Chujaibacter、Rhodanobacter、Mizugakiibacter和物种Rhodanobacter在M-P轮作中更丰富。然而，P-P轮作增加了寡营养细菌（包括纲Thermoleophilia和Saccharimonadia、目Frankiales和属Knoellia）以及病原菌属Bordetella的相对丰度。
具有生防潜力的真菌类群，包括目肉座菌目、属红酵母属和共生真菌物种Saitozyma_flava，在V-P轮作中具有较高的相对丰度。然而，P-P轮作增加了病原真菌类群的相对丰度，包括家族Plectosphaerellaceae、Pleosporaceae和Trichosporonaceae，属炭疽菌属和弯孢属，物种Fusarium equiseti和Colletotrichum truncatum。属Tausonia、物种Rhodotorula toruloides和Apiotrichum laibachii在M-P轮作中富集。
3.5 根际代谢物、土壤性质与微生物多样性及群落组成的关联
微生物多样性与氨基酸、辅因子和维生素的含量呈正相关，但与脂质和嘌呤含量呈负相关。次生代谢物（包括黄酮类、萜类、生物碱和其他含氮化合物以及酚类和其他苯衍生物）主要与多样性指数呈负相关。根际土壤pH、土壤有机质和全氮与微生物多样性正相关。土壤全磷和有效磷分别与细菌和真菌多样性负相关。
Mantel检验结果显示，根际土壤细菌群落组成与除氨基酸外的所有根际代谢物均显著相关。真菌群落组成与脂质、黄酮类、生物碱和其他含氮化合物以及萜类显著相关。黄酮类、生物碱和其他含氮化合物以及萜类对微生物群落组成的影响强于其他代谢物。进一步的变异分配分析发现，次生代谢物主导了微生物群落组成的变异，解释了89.93%的变异。
O2PLS分析（Q2值为0.50和0.51）确定了28和33种次生代谢物为关键驱动因子。这些代谢物主要属于生物碱、萜类和黄酮类。微生物结构变异的最关键驱动因子是macaridine、3-苯基儿茶酚、蜕皮激素棕榈酸酯、佛手酚、天竺葵素和aromadendrin。
讨论
4.1 轮作调节马铃薯根际土壤代谢物组成
本研究的发现支持了作物轮作引发马铃薯根际土壤代谢物丰度和组成变化的假设。轮作系统中主要的初级代谢物（如氨基酸和碳水化合物）更为丰富，尤其是在豇豆-马铃薯轮作中。氨基酸和碳水化合物代谢与碳氮循环相关，主要反映土壤养分积累和微生物活性。我们的结果表明，马铃薯轮作可能促进了根际土壤中的碳、氮和其他养分循环。然而，脂质在连作马铃薯的根际土壤中含量更高。脂质在形成细胞膜和储存能量方面发挥着重要作用，脂质代谢调控是生物适应不利条件的机制之一。连续马铃薯种植可能导致土壤pH降低、养分耗竭和有毒物质积累，这可能进一步诱导微生物结构紊乱，有利于病原菌类群。这些不利条件可能影响马铃薯及相关微生物的脂质代谢，这可以解释其在连作条件下较高的丰度。
主要的次生代谢物（包括酚类、黄酮类、萜类和生物碱及其衍生物）在豇豆-马铃薯轮作中丰度显著较低，但在连作中丰度较高。大多数已鉴定的次生代谢物，如槲皮苷、染料木素、macaridine和二氢白屈菜红碱，可作为化感物质，并可能参与作物的化学防御机制。Rishitin是一种倍半萜植保素，已被充分记录为茄科植物（如番茄和马铃薯）中对抗植物病原体（特别是引起马铃薯晚疫病的Phytophthora infestans）的关键防御代谢物。在我们的研究中，根际土壤中rishitin含量在连作马铃薯中最高，在豇豆-马铃薯轮作中最低。这些结果表明，马铃薯轮作可能缓解了连作作物加剧的病原体压力，强调了轮作管理对病害缓解的直接影响。从防御性代谢物向初级代谢物的转变可能反映了马铃薯在轮作系统中将更多资源从防御重新分配到生长的事实。
4.2 轮作改变根际土壤微生物群落
本研究发现，轮作种植提高了马铃薯根际土壤中细菌和真菌的多样性，并诱导了微生物群落组成的变化。优势细菌门变形菌门和拟杆菌门已被确定为富养型类群，其相对丰度与土壤pH呈正相关。马铃薯根际土壤中有机碳和pH水平较高，可能解释了它们在轮作系统中相对于连作更高的相对丰度。一些生防、固氮、反硝化、甲烷代谢和污染物降解细菌，以及参与养分循环的其他类群在轮作系统中更为丰富。这些结果表明，轮作显著富集了根际土壤中的有益细菌类群。
在马铃薯根际土壤中也鉴定出了一些可引起病害的真菌类群，并且它们在轮作模式间发生了变化。病原相关类群（如镰刀菌属）的优势与毁灭性植物病害（如枯萎病、根腐病和赤霉病）相关。炭疽菌属和弯孢属可导致大豆、玉米和小麦等多种作物发生炭疽病和叶斑病。在我们的研究中，马铃薯轮作显著降低了这些病原菌的相对丰度。结合细菌群落的变化，这些结果可能表明，马铃薯轮作后，根际土壤从真菌主导的群落转向细菌主导的群落。先前关于轮作的研究广泛报道，根际土壤中的假单胞菌属可以通过产生铁载体、吩嗪、上调防御基因以及营养和空间竞争等机制抑制尖孢镰刀菌种群。因此，马铃薯轮作系统中观察到的病原相关类群丰度较低可能与微生物拮抗作用密切相关。选择适当的马铃薯轮作作物有可能控制连作系统中发生的土传病害。
4.3 根际土壤代谢物与土壤微生物组密切相关
我们的研究结果揭示了根际微生物的多样性和群落组成与马铃薯根际代谢物组成之间的显著关系。氨基酸和碳水化合物与细菌的多样性和群落组成呈正相关，这可能与它们为支持特定有益细菌的趋化性提供易利用氮和有效碳的作用一致。研究发现，来自脂质代谢的脂肪酸及其衍生物（如棕榈酸、硬脂酸和油酸）可表现出抗菌特性。与这些先前的研究一致，我们观察到脂质与马铃薯根际土壤中微生物多样性和群落组成之间存在负相关。
结果显示，次生代谢物在调节马铃薯根际土壤微生物群落中起主导作用。其中，黄酮类、生物碱和萜类与细菌和真菌群落组成的变异表现出更强的关联。这些化合物已知具有抗菌或信号特性，可直接重塑微生物群落。例如，萜类可以抑制微生物的呼吸或参与营养获取的酶活性。生物碱会直接渗透微生物的细胞膜，破坏其结构和功能。黄酮类可通过触发氧化应激反应来破坏微生物细胞。在我们的研究中，已鉴定的次生代谢物，如rishitin、diplopterol、竹桃霉素、3-亚甲基吲哚和槲皮苷，都对微生物具有化感潜力，从而影响它们的相对丰度。根际次生代谢物也充当信号分子，对土壤微生物组产生多种效应，包括促进、抑制和驱逐。在我们的研究中，轮作马铃薯种植对马铃薯的生长和产量有积极影响。这可能是由于根际过程的变化，减少了防御性次生代谢物的数量，增加了有益微生物的数量。我们的结果揭示了根际代谢物对微生物群落的调控作用。本研究通过调节根际代谢物与微生物组之间的相互作用，为理解轮作效益的潜在机制提供了独特的见解。
结论
我们的结果表明，轮作对马铃薯的生长和产量有积极影响。马铃薯连作、玉米-马铃薯轮作和豇豆-马铃薯轮作之间的根际土壤代谢物存在显著差异。与马铃薯连作相比，轮作系统中马铃薯的根际土壤代谢物具有更少的防御性次生代谢物，但更丰富的初级代谢物。在马铃薯轮作系统中，根际土壤细菌和真菌的多样性增加，微生物群落组成发生显著变化。更多的有益微生物类群在轮作系统中富集，而优势病原微生物群落的丰度降低，尤其是在豇豆-马铃薯轮作中。根际土壤代谢物与土壤微生物组的多样性和组成显著相关。具有防御功能的特定次生代谢物主导了土壤微生物群落组成的变异。这些发现强调了轮作驱动的根际代谢物变化很可能塑造了土壤微生物组。本研究指出了根际代谢物与微生物组之间潜在的相互作用，为轮作的效益提供了更全面的理论支持。
