《Frontiers in Immunology》：Spatial transcriptomic profiling identifies lacrimal-gland-epithelial cell-driven mechanisms underlying autoimmunity in Sj?gren’s disease
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本研究利用空间转录组学技术在TSP-1缺陷的舍格伦综合征（SjD）小鼠模型中，首次系统地描绘了泪腺上皮细胞亚型在自身免疫病理中的关键作用。文章揭示了腺泡细胞的内质网应激、导管细胞的线粒体功能障碍和肌上皮细胞的促纤维化重塑，并发现导管上皮细胞能通过提供IL-6和MHC-II表达等分子线索，主动驱动富含B细胞和T滤泡辅助细胞的生发中心形成，为SjD的诊疗提供了新的上皮细胞靶点和理论框架。
本研究题为“通过空间转录组学分析鉴定泪腺上皮细胞驱动舍格伦综合征自身免疫的机制”，旨在深入探讨舍格伦综合征（SjD， 又称干燥综合征）中泪腺病理学的细胞和分子基础。SjD是第二常见的风湿性疾病，其特征是自身免疫病理靶向产泪的泪腺，导致慢性眼表疾病。尽管已有重要进展，但SjD中泪腺的病理学仍不完全清楚，这限制了对该病的诊断和治疗。本研究采用了空间转录组学这一前沿技术，对野生型（WT）小鼠和血小板反应蛋白-1缺陷（TSP-1-/-）SjD自发模型小鼠的泪腺进行了分析，旨在识别与主要上皮细胞亚型（腺泡细胞、导管细胞和肌上皮细胞）功能丧失相关的分子特征。
3.1 将细胞类型和转录程序映射到泪腺结构
为了在空间组织的背景下确定泪腺结构成分的转录程序，本研究进行了数字空间分析。研究人员使用了TSP-1-/-和WT小鼠泪腺组织的石蜡包埋切片。在TSP-1-/-小鼠的H&E染色切片中可检测到特征性的导管周围和血管周围单核细胞浸润，而正常WT泪腺中则没有。通过免疫荧光成像和区域选择，研究人员根据细胞类型特异性标记物和形态，在每个感兴趣区域内识别出用于富集腺泡、肌上皮、导管和免疫细胞的自定义照明区域。通过对总共28个泪腺组织样本（来自4只TSP-1-/-鼠的16个切片和来自3只WT鼠的12个切片）的分析，测序获得了超过27,500个转录本。使用已公开的单细胞RNA测序数据集作为参考进行反卷积分析后，共检测到12个主要的细胞簇。当映射到各区域时，87%的细胞类型程序基因被检测到高于背景水平。腺泡、导管和肌上皮细胞区域内的转录程序在组间的变异性大于组内。在上皮细胞中，在腺泡上皮细胞中检测到最多的差异表达基因，其次是导管和肌上皮细胞。在腺泡上皮细胞中，大多数差异表达基因上调，而在导管上皮细胞中则以下调为主，在肌上皮细胞中上调和下调的差异表达基因比例相等。此外，对WT和TSP-1-/-腺体中主要免疫细胞群（包括T细胞、B细胞、浆细胞和单核细胞）的比较显示，TSP-1-/-腺体中含有B细胞、浆细胞以及T细胞的区域更多。
3.2 TSP-1缺陷腺泡上皮细胞中的内质网应激途径破坏其分泌功能并促进自身免疫病理
对WT和TSP-1-/-泪腺中腺泡上皮细胞的转录组谱进行分析，旨在确定其基因表达模式是否代表了TSP-1-/-小鼠中观察到的功能丧失和自身免疫的潜在机制。总体而言，线粒体ATP酶的表达模式伴随着显著的差异表达基因，包括下调的抗氧化酶基因（如Gpx7和Prdx4）以及上调的内质网应激相关基因（如Erp29、Ern1、Eif2ak3和Atf6b）。在TSP-1-/-细胞中，ATP酶、抗氧化酶和内质网应激相关转录本的这种协调变化也得到了在显著改变的差异表达基因中富集的内质网应激相关途径的支持。此外，在TSP-1-/-腺泡细胞中，检测到Calm3基因的显著下调，该基因编码上皮细胞特异性钙传感蛋白Calml3，以及编码钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶IIβ链的Camk2b基因。这些结果不仅与线粒体ATP酶在腺泡上皮分泌过程的高能量需求中的关键作用一致，也提示了由线粒体ATP酶活性增加可能导致活性氧介导的氧化应激失调，进而导致内质网应激，促成腺泡上皮细胞的功能丧失。
未解决的内质网应激可通过多种机制激活核因子κB并导致炎症反应。这种密切的相互作用也反映在TSP-1-/-腺泡上皮细胞中编码核因子κB蛋白的基因（Nfkb2）表达显著增加，这与之前报道的这些细胞中炎性小体的形成及相关的炎症细胞因子白细胞介素-1β水平升高一致。内质网应激的下游效应之一是转录因子ATF6驱动的内质网伴侣蛋白（包括钙网蛋白）的产生，作为未折叠蛋白反应的一部分，以增强蛋白质折叠能力并减轻错误折叠蛋白质的积累。在TSP-1-/-腺泡上皮细胞中，检测到Atf6和编码钙网蛋白的Calr基因的上调。这一变化也通过免疫染色检测到钙网蛋白增加得到证实。
此外，在TSP-1-/-腺泡上皮细胞中，检测到编码水通道蛋白5的Aqp5基因显著下调，同时紧密连接蛋白如闭合蛋白（Cldn3、Cldn4、Cldn7、Cldn8和Cldn34c2）也显著下调，这些蛋白与液体分泌所必需的水分受控移动有关。这些变化反映了跨膜水转运和泪液分泌的关键成分的破坏，并与舍格伦综合征患者泪腺中水通道蛋白5失调的报道一致。此外，在TSP-1-/-腺泡上皮细胞中，注意到编码多聚免疫球蛋白受体（对于将腺体浆细胞产生的二聚体免疫球蛋白A跨细胞转运至泪液中成为分泌型免疫球蛋白A至关重要）的Pigr基因显著下调。这一发现进一步得到TSP-1-/-小鼠泪液中分泌型免疫球蛋白A水平显著降低的支持，这与舍格伦综合征患者中的观察一致。总之，这些结果确定了可能导致TSP-1-/-泪腺中腺泡上皮细胞分泌功能破坏和自身免疫炎症反应发展的潜在分子机制。
3.3 离子转运和钙信号传导的破坏导致TSP-1缺陷导管上皮细胞的分泌功能障碍
泪腺的导管上皮细胞通过精细调节腺泡上皮细胞产生的富含蛋白质的原泪液参与泪液分泌。这种调节涉及水和电解质（如钾离子和氯离子）的添加和调节，以调整最终泪液的成分、渗透压和体积。用于实现这种调节的一些离子转运蛋白包括钠钾ATP酶、钠钾氯协同转运蛋白1、囊性纤维化跨膜电导调节因子和上皮钠通道。在本研究中，检测到编码这些转运蛋白的基因（如Atp1a1、Atp1b1、Slc12a2、Cftr、Scnn1a、Scnn1b、Scnn1g）以及编码钾通道、碳酸氢钠转运蛋白、钠氢交换器和线粒体溶质载体的基因显著下调。上皮钠通道表达显著降低已通过免疫染色证实。此外，在TSP-1-/-导管上皮细胞中检测到线粒体ATP酶的表达下调。线粒体ATP酶表达降低最主要源于线粒体功能障碍和电子传递链受损，从而限制了ATP的产生。这种观察到的基因谱也得到与线粒体电子传递相关途径基因显著下调的支持。另外，在TSP-1-/-导管上皮细胞中注意到编码钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II抑制剂的Camk2n1显著下调。这些结果在空间上与TSP-1-/-导管上皮细胞分泌功能的显著丧失相关，这可能有助于解释这些小鼠中观察到的泪液成分受损和眼表疾病。
3.4 TSP-1缺陷肌上皮细胞与腺泡上皮细胞的相互作用受损是泪腺结构和功能损伤的基础
除了对推动泪液排出至关重要的肌上皮细胞收缩能力外，其再生潜力被认为在维持腺体结构中起重要作用。空间分析数据为我们提供了一个独特的机会来探究WT和TSP-1-/-泪腺中肌上皮细胞和腺泡上皮细胞之间的相互作用。我们识别了在WT和TSP-1-/-腺体中各区域内共表达的、空间上定义的受体-配体对。如图所示，尽管一些受体-配体对在两种腺体中都具有良好的相关性，但许多对在WT和TSP-1-/-组织之间存在差异相关性。在正常WT泪腺中，高度相关的显著相互作用包括肌上皮细胞衍生的层粘连蛋白-1与腺泡上皮细胞上的整合素受体之间的相互作用，这些作用已知可促进腺泡细胞的极性、存活和分化，以及对于泪腺结构和功能完整性重要的粘附分子之间的相互作用。WT泪腺中生长因子与受体（如表皮生长因子及其受体，成纤维细胞生长因子及其受体2）之间的显著相关性凸显了表皮生长因子信号在腺泡上皮细胞分泌功能中的重要性，以及生长因子在促进肌上皮细胞增殖和迁移中的作用。在TSP-1-/-组织中，缺乏部分此类相互作用或此类相互作用在显著相关的受体-配体对中相对较少，这与TSP-1-/-腺体中观察到的结构和功能丧失相符。TSP-1-/-肌上皮细胞和腺泡上皮细胞之间缺乏显著的表皮生长因子及其受体、闭合蛋白3之间的相关性，得到了TSP-1-/-肌上皮细胞中Egf表达显著降低以及TSP-1-/-腺泡上皮细胞中Cldn3表达显著降低的支持。
与WT腺体中的层粘连蛋白-1不同，在TSP-1-/-腺体中，与整合素结合的高度相关的细胞外基质蛋白主要包括纤维连接蛋白和胶原蛋白，这些蛋白与损伤后的上皮修复有关。事实上，TSP-1-/-腺体中显著的受体-配体相关性（如Tgfb1与Tgfbr2，Fn1与Itgb1，Col4a1与Itga3，Col1a2与Sdc4）提示促纤维化过程，并伴随着胶原蛋白表达的增加，这些胶原蛋白已知在组织修复期间的细胞外基质重塑中发挥不同作用。胶原蛋白的类似增加表达以前在微阵列研究中也曾在TSP-/-肌上皮细胞中报道过。然而，已知可调节胶原纤维组装和组织、为形成细胞外基质支架所需的XIV型胶原Col14a1的表达显著降低，表明细胞外基质组织受损。此外，淀粉样前体蛋白与主要组织相容性复合体不变链之间的显著相关性，与TSP-1-/-腺泡上皮细胞中CD74表达增加一致。类似的上皮细胞CD74表达增加在各种组织损伤性疾病和炎症反应（包括自身免疫疾病）中均有报道。
我们还检测到在TSP-1-/-肌上皮细胞中，脂质代谢相关途径在差异下调基因中富集。由于脂质代谢已知通过各种机制支持平滑肌收缩，这一发现提示TSP-1-/-肌上皮细胞可能存在收缩反应丧失。这种可能性也得到钙传感编码基因Calml3表达显著降低的支持，这进一步证实了先前报道的TSP-1-/-肌上皮细胞原代培养物中钙信号和收缩反应改变的体外观察结果。总之，我们的研究结果表明，肌上皮细胞与腺泡上皮细胞之间特定相互作用的破坏及其收缩功能，是导致TSP-1-/-泪腺中观察到的结构和功能丧失的重要因素。
3.5 TSP-1缺陷泪腺中的导管周围免疫浸润形成生发中心
如先前报道，我们在TSP-1-/-泪腺中观察到舍格伦综合征病理学特征性的导管周围和血管周围淋巴细胞聚集，而WT泪腺中没有。在我们的数字空间分析研究中，含有免疫浸润的区域中CD45染色非常弱，我们通过染色额外的切片证实了这一点。在免疫细胞中，B细胞亚群中报告有低CD45表达，这与其增强的存活和自身免疫有关。用B细胞标记物B220对这些聚集物进行染色证实了B细胞占主导地位。在TSP-1-/-泪腺中含有此类聚集物的三个区域的转录组谱中检测到与生发中心B细胞和T滤泡辅助细胞相关的标记物表达，提示存在活化的B细胞。此外，对聚集物中差异表达基因的途径分析显示，与生发中心形成相关的途径显著富集，提示淋巴细胞聚集物是活跃的生发中心。我们还检测到Bcl6（T滤泡辅助细胞的谱系定义转录因子）阳性的CD4阳性细胞。这些细胞在TSP-1-/-泪腺的生发中心以及导管周围免疫细胞中被发现，进一步验证了我们的淋巴细胞聚集物基因表达谱。为了确定在TSP-1-/-泪腺中观察到的生发中心是否与通常与系统性自身免疫相关的自发性脾脏生发中心形成相关，我们评估了WT和TSP-1-/-脾脏切片。相对于WT脾脏，在TSP-1-/-脾脏中观察到更多被B220+Bcl6+生发中心B细胞和B220-Bcl6+T滤泡辅助细胞标记的活化滤泡。我们进一步证实了T滤泡辅助细胞是CXCR5+CD4+细胞，在TSP-1-/-脾脏的滤泡外围和内部可见，而在WT脾脏中则不同。这些结果共同支持了泪腺中存在异位生发中心，这与TSP-1-/-小鼠的自发性脾脏生发中心相关，与其系统性自身免疫一致。
3.6 TSP-1缺陷泪腺中导管上皮细胞附近的免疫细胞包括能够招募T滤泡辅助细胞和生发中心B细胞的抗原呈递细胞
在我们的数字空间分析中，含有导管的区域包括在WT和TSP-1-/-泪腺中，靠近细胞角蛋白染色导管上皮细胞的CD45染色。一些导管区域显示出比其他区域更高的CD45染色强度，TSP-1-/-腺体中显示高CD45染色的比例（40%）高于WT腺体（22%）。我们比较了具有高和低CD45染色强度的导管区域转录谱，并观察到与抗原呈递细胞相关的基因表达与CD45强度相关。这种相关性提示抗原呈递细胞存在于占据导管周围间隙的免疫细胞中，表明泪腺中导管上皮细胞与抗原呈递细胞之间存在先前未被认识的空间关系。
先前的研究已确定抗原呈递细胞（特别是单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞）是炎症条件下通过Toll样受体7/9、Toll样受体4和肿瘤坏死因子-α等细胞因子信号通路的激活而产生CXCL13的来源。考虑到TSP-1-/-泪腺中浸润的CXCR5+T滤泡辅助细胞和生发中心B细胞的导管周围定位，我们比较了TSP-1-/-和WT组织中导管上皮附近免疫细胞中CXCL13及相关炎症介质的表达。如图所示，来自TSP-1-/-腺体的几个区域显示了这些基因的上调表达，并且免疫染色证实了CXCL13与CD45的共定位，支持导管周围生发中心的形成。此外，与WT泪腺相比，TSP-1-/-腺体中的导管上皮细胞显示出显著增加的主要组织相容性复合体II类分子表达，表明它们在腺体炎症期间可能参与自身抗原的呈递。
3.7 TSP-1缺陷泪腺中的导管上皮细胞提供了形成生发中心的微环境
导管上皮细胞与抗原呈递细胞的邻近性提示了导管上皮细胞衍生因子可能影响由抗原呈递细胞诱导的局部免疫反应的可能性。在自身免疫病理学中，白细胞介素-6是一种关键的细胞因子，已知可驱动B细胞的多克隆活化以促进自身反应性克隆的出现，促进有助于生发中心形成的T滤泡辅助细胞的分化，并与CXCL13协同作用以招募和保留B细胞和T滤泡辅助细胞。我们在TSP-1-/-泪腺的几个导管上皮区域检测到相对较高的白细胞介素-6表达。为了验证这一发现并确定导管上皮细胞是否有助于形成支持导管周围生发中心的微环境，我们按照“材料和方法”中所述，生成了泪腺来源的导管上皮细胞的原代培养物。通过确认这些培养物表达上皮细胞标记物（细胞角蛋白）和导管上皮细胞标记物（囊性纤维化跨膜电导调节因子），以及肌上皮细胞和腺泡细胞标记物（α平滑肌肌动蛋白和Rab3d）染色极少或无法检测到，验证了这些培养物。收集来自WT和TSP-1-/-泪腺的导管上皮细胞培养物的24小时培养上清液，以比较其白细胞介素-6的分泌。如图所示，在TSP-1-/-导管上皮细胞培养物中检测到显著增加的白细胞介素-6水平，而WT对照培养物则较低。已知上皮细胞影响局部免疫反应的另一种方式是作为非专业抗原呈递细胞，在干扰素-γ的刺激下表达主要组织相容性复合体II类分子，并参与效应CD4+ T细胞的活化。我们接下来评估了TSP-1-/-导管上皮细胞在响应干扰素-γ而表达主要组织相容性复合体II类分子的能力方面是否与WT对照不同。如图所示，在TSP-1-/-导管上皮细胞中检测到主要组织相容性复合体II类分子的表达显著增加。这一结果通过在这些细胞中对主要组织相容性复合体II类分子进行免疫染色得到证实。总之，这些结果支持了导管上皮细胞通过促进TSP-1-/-泪腺中导管周围生发中心的形成来塑造局部免疫反应的潜力。
4 讨论
先前的研究报道，血小板反应蛋白-1介导转化生长因子-β的活化、免疫耐受和泪腺功能的维持，其缺失是舍格伦综合征相关自身免疫的基础。在小鼠中删除血小板反应蛋白-1产生了一个密切模拟舍格伦综合征患者中观察到的疾病渐进过程的模型，为剖析驱动病理学的细胞和分子机制提供了一个强大的系统。通过对健康和血小板反应蛋白-1缺陷小鼠泪腺组织进行数字空间分析，我们识别了有助于自身免疫和腺体损伤的上皮细胞与免疫细胞之间的空间相互作用。这种方法通过增加空间背景，补充了单细胞RNA测序的发现，揭示了可能导致泪腺结构和功能丧失的上皮驱动分子机制。此外，我们的研究结果强调了促进导管周围浸润和生发中心形成的组织微环境变化，这些都是舍格伦综合征病理学的标志。
内质网应激已成为包括风湿性疾病在内的自身免疫的关键因素。由内质网应激激活的未折叠蛋白反应调节先天性和适应性免疫，但其在舍格伦综合征受累泪腺中的激活先前尚不清楚。腺泡上皮细胞的转录谱分析揭示了TSP-1-/-泪腺中内质网应激途径上调，这与舍格伦综合征患者唾液腺中的发现以及缺乏内质网驻留伴侣蛋白的模型中的发现相似。此外，内质网应激可触发促炎性核因子κB信号传导、NLRP3炎性小体激活和细胞死亡，这与先前观察到的TSP-1-/-泪腺上皮细胞中炎性小体形成和凋亡一致。内质网应激下游标记物钙网蛋白的升高支持了这种表型。其上调与免疫原性细胞死亡和异常的免疫激活有关，有助于自身抗体的产生，并参与Ro60（SSA）表位的呈递。这些机制共同解释了TSP-1-/-小鼠和舍格伦综合征患者中存在抗Ro和抗钙网蛋白自身抗体。此外，舍格伦综合征中的结构性泪腺损伤也表现为Pigr表达降低，破坏了免疫球蛋白A的跨细胞转运，从而降低了泪液分泌型免疫球蛋白A的水平。由于分泌型免疫球蛋白A在粘膜炎症疾病中调节共生微生物群，泪液分泌型免疫球蛋白A减少与先前报道的TSP-1-/-小鼠微生物群改变相关，并可能作为腺体上皮损伤的生物标志物。
除了腺泡细胞功能障碍外，我们还确定了导管上皮损伤的潜在机制，这对于调节维持眼表完整性的泪液成分至关重要。这些细胞通过转运蛋白和通道的表达维持离子平衡，产生富含钾离子和氯离子的泪液。在兔舍格伦综合征模型和TSP-1-/-小鼠中，钠钾ATP酶和离子通道表达的降低与泪腺功能障碍和眼表疾病相关。线粒体ATP合酶和电子传递链组分的下调提示线粒体功能障碍，这在自身免疫疾病发病机制中有所涉及。受损的线粒体会释放核酸和损伤相关分子模式，从而放大炎症。TSP-1-/-肌上皮细胞和腺泡细胞中钙信号相关分子Calml3表达的降低进一步表明收缩和分泌功能受损。空间分析还揭示了促纤维化的肌上皮细胞-腺泡细胞相互作用和细胞外基质重塑特征，这与患者干眼症相关的纤维化进展以及晚期舍格伦综合征中观察到的腺体萎缩一致，提示它们有潜力作为疾病进展的早期生物标志物。
舍格伦综合征中的慢性泪腺炎症以导管周围和血管周围的B细胞和T细胞浸润为特征，这些浸润形成支持局部自身抗体产生的生发中心。泪腺上皮细胞对促进生发中心形成的贡献仍未明确。我们的研究证明了TSP-1-/-泪腺和脾脏中以B细胞为主的导管周围浸润和自发性生发中心形成，这与小鼠模型以及患者中的血清学舍格伦综合征标志物一致。空间定位识别出抗原呈递细胞与导管上皮细胞相邻——这是一个先前未被描述的现象——提示了从泪液分泌中进行自身抗原取样的可能性。其中一些抗原呈递细胞表达信号分子Toll样受体和肿瘤坏死因子-α，已知可诱导吸引T滤泡辅助细胞和生发中心B细胞的趋化因子CXCL13，这解释了泪腺中浸润
