《Frontiers in Immunology》：Cellular signatures of immune dysregulation in inborn errors of immunity: development of a quantitative immune balance score
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本文介绍了一种新的生物标志物——免疫失调评分（IDS），它通过量化免疫系统中促炎与调节性细胞亚群之间的失衡，来表征先天免疫性疾病（IEIs）特别是原发免疫调节障碍（PIRDs）的免疫失调状态。研究结合多参数流式细胞术与计算模型，发现IDS能有效区分患者与健康对照，并与临床严重程度相关，为理解PIRDs的发病机制、患者分层及精准治疗监测提供了有价值的转化框架。
引言
免疫失调代表了宿主对自身或非自身抗原反应的一种病理性失衡，表现为过度的炎症或调节活性。在先天性免疫性疾病（IEIs）的范畴内，此类缺陷通常被归类为免疫失调性疾病和调节性T细胞疾病，统称为原发免疫调节障碍（PIRDs）。PIRDs患者的临床表现广泛且异质，超越了IEIs传统相关的感染易感性，涵盖了自身免疫、慢性炎症、淋巴细胞增生和恶性肿瘤。这凸显了PIRDs并非独立表型，而是IEI背景下的一个重要亚类，其中感染易感性和失调的免疫反应是疾病的双重标志。理解遗传扰动如何重塑炎症性和调节性免疫细胞亚群之间的平衡至关重要。本研究旨在描述免疫失调背后的细胞变化，并开发一个整合性生物标志物框架，将炎症/调节失衡与遗传背景和临床表型联系起来。
材料与方法
研究纳入了2019年至2023年间就诊的39名经基因定义的IEI患者（包括PIRD和非PIRD病例）和17名年龄匹配的健康对照。收集了患者的人口统计学数据和临床病史。通过密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（PBMCs），使用预滴定抗体面板进行染色，以表征炎症性和调节性免疫细胞亚群。数据在流式细胞仪上获取，并使用FlowJo软件进行分析。统计分析采用R和Python进行，包括相关性网络分析、t-SNE降维、FlowSOM无监督聚类等。为量化免疫失调，研究者计算了免疫失调评分（IDS），定义为炎症标志物（激活的CD8+CD25+T细胞、BCL6+、ICOS+BCL6+T细胞）的几何平均数与调节标志物（FOXP3+调节性T细胞、过渡期Breg细胞和记忆Breg细胞）的几何平均数之比的常用对数。临床失调评分（CDS）则通过系统评估自身免疫/炎症特征、恶性肿瘤、淋巴结病、反复感染、低/高丙种球蛋白血症和肝脾肿大等临床领域的存（1）无（0）来计算。
结果
相关性分析揭示患者免疫网络的扰动
在健康对照中，调节性和炎症性亚群形成了紧密协调的网络，而患者的这种协调结构被显著破坏。Δ-相关性分析进一步揭示了患者的失衡状态。调节性T细胞亚群（CD4+CD25hiCD127loFOXP3+）的互联性降低，与滤泡辅助标记物如CXCR5和ICOS的关联减弱。相反，包括IL-17A+T细胞、CCR6+亚群、激活的CD8+T细胞（HLA-DR+）和浆母细胞在内的炎症性群体显示出增强的正相关性，表明炎症网络的同步扩张。网络可视化揭示了清晰的结构转变：健康对照以密集的调节性连接为特征，而患者网络则表现出调节性节点的碎片化和炎症性中心的出现，后者主导了网络结构。这些发现表明，IEIs中的免疫失调不仅反映了特定亚群的定量变化，也反映了细胞关系的深刻重构。
患者细胞频率的改变
组间比较揭示了多个细胞群的显著改变。患者的CD4+CD25hiCD127loFOXP3+调节性T细胞频率显著降低，而CD8+CD25+T细胞增多。炎症相关的BCL6+Tfh样亚群和ICOS+BCL6+细胞增多，而记忆T细胞减少。过渡期Breg细胞群也显著减少。通过t-SNE降维发现，尽管存在遗传和临床异质性，患者样本趋向于聚集在一个紧凑的免疫图谱中，与对照组观察到的更广泛、更异质的分布形成对比，表明IEIs中存在共同的炎症特征。
免疫失调评分（IDS）的开发与性能
基于这些一致的改变，研究者推导出一个量化免疫失衡的指标——免疫失调评分（IDS）。IDS是三种炎症性标志物与三种调节性标志物的几何平均数之比的常用对数。受试者工作特征（ROC）分析显示，IDS在区分患者与健康对照方面表现出强大的判别能力，曲线下面积（AUC）为0.747。这表明IDS有潜力作为区分患者与对照的生物标志物。
无监督元聚类分析揭示调节状态的丧失
无监督聚类揭示了八个主要的元聚类（MC1-MC8），它们包含了不同的炎症性和调节性细胞亚群。健康对照以MC2（CD8+CD28+和初始T细胞）、MC4（调节性FOXP3+亚群）和MC5（Helios+调节性T细胞）为特征，反映了平衡的免疫结构。相比之下，患者表现出重新分布，MC2（效应/炎症中心）扩张，而MC4等调节性聚类显著减少，过渡期B细胞聚类MC3完全缺失。河流图可视化显示了患者向效应和炎症中心谱系的倾斜。热图和火山图分析揭示了MC2和MC5中ICOS+、BCL6+细胞和IL-17A的富集，同时记忆特征减弱。这些结果表明，IDS以定量重构和定性状态变化为特征，伴随着调节性T细胞和B细胞亚群的丧失以及炎症/浆母细胞相关区室的出现。
临床失调评分（CDS）与严重程度分层
临床失调基于主要免疫失调表现的存（1）无（0）进行评估，包括自身免疫、慢性炎症、淋巴细胞增生和恶性肿瘤。每个表现单独评分后求和，得到综合临床失调评分（范围0-4），数值越高表明多种失调特征共存。变量重要性分析确定了对聚类边界影响最大的前三个因素：（1）自身免疫/炎症表现，（2）肝脾肿大，（3）淋巴结病。轻度集群主要由缺乏自身免疫/炎症表现、无淋巴结病或肝脾肿大以及免疫球蛋白水平正常驱动。中度集群代表一个异质性群体，患者表现出所评估临床特征的可变组合，没有主导模式。而重度集群则由多种临床异常（包括自身免疫/炎症表现、淋巴结病、肝脾肿大、反复或严重感染、低丙种球蛋白血症，某些病例还包括恶性肿瘤）的共存所定义。
免疫、临床和遗传维度的整合
结合免疫失调评分和临床失调评分，研究者进一步整合免疫、临床和遗传维度，以实现对疾病严重程度的统一、多维表征。临床特征的多维尺度分析将患者分为三个集群，对应于轻度、中度和重度疾病。通过河流图与遗传病因学整合，揭示了基因型-表型关联。LRBA缺陷、STAT1功能获得性（GOF）和STAT3-GOF主要映射到集群1（重度）；DOCK8缺陷富集于集群2（中度）；而STAT3功能丧失性（LOF）、HAX1和ADA2缺陷则出现在集群3（轻度）。
IDS与临床严重程度一致并能区分PIRD表型
将IDS与CDS整合的t-SNE分析揭示了三个离散的患者集群，对应于轻度、中度和重度疾病表型，表明当免疫平衡指标与临床数据结合分析时，可以捕捉到临床异质性。与此一致，平衡评分与临床综合z评分呈显著负相关，突出了随着疾病严重程度增加，炎症性区室逐渐占据主导。关键的是，在分析临床定义的亚组时，出现了明显区分。符合PIRD标准的患者显示出明显更高的IDS值，而非PIRD的IEI患者的IDS水平与健康对照相当。这一发现强调，IDS不仅仅是免疫缺陷的标志，更是免疫失调本身的量化反映。这些结果共同弥合了细胞免疫改变、计算建模和真实世界临床表型之间的鸿沟，表明IDS提供了一个整合的、具有临床意义的免疫失衡衡量标准，有助于解释整个IEI谱系中的疾病严重程度和表型异质性。
复合评分分析
尽管单独使用IDS能清晰区分患者与对照，但其在不同严重程度组间的判别能力有限。为了改进这一点，研究者开发了一个整合了炎症平均值、调节平均值、IDS和ΔIDS的复合模型。随机森林（RF）的特征重要性分析强调IDS和ΔIDS是最强的预测因子。ROC分析证实，复合模型在区分轻度和中度组方面实现了适度改进，尽管由于固有的异质性，重度病例的分类效果仍然较差。校准和决策曲线分析（DCA）进一步表明，广义线性模型（GLM）提供了更稳定的估计和适度的净收益，而RF倾向于高估风险并表现出可变性能。
讨论
本研究通过多参数流式细胞术和先进的计算建模，广泛描述了IEI患者的免疫学表型。分析揭示了免疫细胞网络的显著改变，突出了炎症与调节区室之间的失衡是免疫失调的标志。重要的是，IDS在PIRD患者中显著升高，而在非PIRD的IEI病例中保持低水平。这表明IDS具体表征了失调特有的免疫失衡，而非固有地反映免疫缺陷，从而在异质的IEI谱系中区分出临床相关亚组。
在细胞水平，研究者一致观察到FOXP3+调节性T细胞和过渡期Breg细胞减少，同时BCL6+、ICOS+BCL6+Tfh样亚群和激活的CD8+T细胞增多。这些变化与FOXP3突变、CTLA4和LRBA缺陷以及STAT3功能获得性疾病中描述的情况一致，其中免疫耐受的破坏促进了过度的炎症细胞扩张。网络分析进一步揭示了调节性中枢的断裂和炎症性节点的增强。
为量化这些扰动，研究者建立了一个整合六个跨调节和炎症区室的判别标志物的免疫失调评分（IDS）。IDS有效地将患者与对照区分开，并与临床严重程度相关，支持其作为免疫稳态反映指标的价值。聚类结果与PIRD队列中反复描述的主要临床领域高度一致。先前对CTLA-4单倍体不足、LRBA缺陷及相关免疫失调综合征的研究始终强调三个主要表型轴：（i）多器官自身免疫和炎症，（ii）伴有淋巴结病和肝脾肿大的淋巴细胞增生，以及（iii）以低丙种球蛋白血症和反复感染为特征的免疫缺陷，部分患者报告恶性肿瘤。本研究中数据驱动的轻度-中度-重度聚类再现了这些相同的维度，表明在无监督分析中确定的严重程度梯度反映了PIRD的核心病理生物学，而非队列特异性模式。
将IDS与CDS整合，将患者分为与潜在遗传病因学一致的三个集群。重度集群以STAT3-GOF、STAT1-GOF和LRBA缺陷为主，而较轻的组则与STAT3-LOF、HAX1和ADA2相关。这些基因型-表型关联展示了IDS作为连接细胞改变与临床结局的生物标志物的转化潜力。结合IDS、ΔIDS、炎症和调节细胞平均值的复合机器学习模型略微改善了轻度和中度病例的分组，尽管由于固有的异质性，重度表型的分辨效果仍然不佳。这一局限性与先前在自身免疫和原发性免疫缺陷预测建模中的经验一致，其中重度疾病反映了多种趋同机制。
在方法学上，本研究遵循了现代生物标志物开发的方向，不仅强调判别能力，也强调校准和现实世界的临床价值。决策曲线分析显示适度的净收益，表明基于平衡的指标可以实际整合到决策支持工具中。在临床上，IDS提供了几种潜在应用。它提供了一个客观的、可量化的免疫平衡测量标准，可能为监测疾病进展或治疗反应增加临床参数的补充价值。其核心细胞成分（Tregs、Bregs、Th17样和激活的CD8+T细胞）代表了免疫调节治疗的动态靶点。如CTLA4-Ig和JAK-STAT抑制剂等药物，已直接用于调节这些区室。连续的IDS监测因此可以作为药效学生物标志物，指示免疫调节/炎症平衡的恢复是否伴随临床改善。将此类细胞生物标志物整合到治疗试验中，可以融合分子和临床数据，推动精准免疫学从静态诊断向动态疾病监测发展。
总结
总之，本研究发现免疫失调的特征是调节网络破坏、炎症亚群扩张和细胞聚类重新分布。IDS可靠地区分了患者与对照，并与临床严重程度相关。扩展此方法，整合多个免疫参数的复合模型略微改善了对轻度和中度病例的判别，但在重度疾病中性能仍然有限，这突显了需要额外的分子特征来完善预测准确性。通过区分PIRD与非PIRD表型并与临床严重程度相关，IDS既提供了机制性见解，也具有转化潜力。未来的方向应侧重于将IDS纳入前瞻性、纵向队列，以确定其作为治疗反应和临床结局生物标志物的效用。与多组学方法整合可能完善生物标志物组合，并揭示失调的分层特征。将此类定量免疫平衡指标嵌入临床工作流程，可能实现个性化的疾病监测和靶向治疗决策，为管理免疫失调综合征的精准免疫学铺平道路。
