从天然死亡的花生象鼻虫（Helicoverpa armigera）幼虫中分离出的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）所产生的一种新型昆虫毒性蛋白的分子和生化特性研究

《Journal of Plant Biochemistry and Biotechnology》：Molecular and biochemical characterization of a novel entomotoxic protein from Bacillus subtilis Isolated from naturally killed pod borer (Helicoverpa armigera) larvae in pigeonpea

鹰嘴豆虫害生物防治研究中，从死亡幼虫中分离出Bacillus subtilis菌株B，其46kDa GHKL域蛋白在柱层析纯化后对 Helicoverpa armigera 幼虫死亡率达93.75%。

　　

摘要

木豆（Cajanus cajan L. Millsp.）是全球重要的豆类作物。然而，其产量受到害虫的严重限制，尤其是Helicoverpa armigera，这种害虫会损害花朵和豆荚，导致产量大幅下降。为了开发环保的害虫管理策略，从自然死亡的幼虫中分离出了六种细菌菌株（A–F），并评估了它们的蛋白质提取物对幼虫生长和死亡率的影响。菌株B的蛋白质导致了最高的死亡率（68.75%），其次是菌株C，而菌株A、D、E和F则没有显著效果。菌株B被鉴定为Bacillus subtilis，这是一种革兰氏阳性、杆状、具有运动能力且能形成孢子的细菌，最适生长条件为pH 7–8和25–35°C，并且具备柠檬酸利用、酪蛋白水解、淀粉水解、明胶水解、硝酸盐还原、过氧化氢酶和芸香苷水解的能力。蛋白质组学分析显示不同菌株之间存在蛋白质表达差异，其中菌株B表达了一种新的约46 kDa的蛋白质条带，与杀虫活性相关。粗蛋白和硫酸铵分级蛋白（60%和70%）通过凝胶过滤色谱法进行纯化，其中70%分级中的蛋白质含量最高。SDS-PAGE分析确认70%分级中存在约46 kDa的蛋白质，并选择该蛋白质进行N端测序。二维凝胶电泳和MALDI-MS鉴定了七个蛋白质点（26–60 kDa），并对其进行了功能注释。生物测定表明70%分级具有最高的幼虫死亡率（93.75%）。基因特异性PCR扩增出一个488 bp的cDNA片段，经克隆和测序后发现该片段与Bacillus pumilus中含GHKL结构域的蛋白质100%相似，同源性分析将蛋白质点2与该克隆蛋白质联系起来，证实了其在幼虫致死中的作用。这些发现表明，B. subtilis衍生的蛋白质，特别是约46 kDa的GHKL结构域蛋白质，是有效且环保的生物控制剂，可用于可持续管理木豆中的Helicoverpa armigera。