《Sustainable Food Technology》：High-pressure technology: application as a pretreatment technique for de-bittering and fermentation acceleration of green table olives
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本文首次系统评估了高压预处理技术在青橄榄脱苦与发酵中的应用。研究表明，相比传统“希腊式”长期发酵（数月）或碱液处理，高压处理可瞬间实现高达80%的橄榄苦苷（oleuropein）降解，将脱苦时间缩短至数小时，并将后续发酵周期缩减一半以上，同时大幅减少化学碱液使用。该技术通过物理高压破坏细胞壁，促进内含物释放与乳酸菌生长，最终在保持产品感官、质构与营养品质的同时，提供了高效、环保的橄榄加工新策略。本文深入探讨了高压参数优化、微生物种群动态变化与产品质量评价，为食品工业的可持续发展提供了创新思路。
高压技术：一种加速橄榄脱苦与发酵的预处理新策略
引言
食用橄榄的消费量在过去二十年间持续增长，这得益于其在地中海饮食中的流行度和已被证实的健康效益。食用橄榄富含酚类化合物，这些物质以其抗氧化特性而广为人知。然而，其中一些化合物，如橄榄苦苷（oleuropein），会带来强烈的苦味，使得新鲜橄榄无法直接食用。为了使食用橄榄能够被接受，必须经过一系列加工步骤，包括脱苦、发酵和酸化。脱苦是一个必要的过程，旨在减少与特征性苦味相关的酚类化合物（如橄榄苦苷及其苷元）的含量，增加橄榄的渗透性以加速后续盐渍步骤，并提高消费者的接受度。
最著名和最广泛使用的食用橄榄脱苦方法是“希腊式”、“西班牙式”和“加州式”工艺。传统的希腊式脱苦包括将橄榄浸入盐水（5-10% w/w）中数月，苦味酚类化合物通过扩散从橄榄肉进入盐水，同时被橄榄表面的内源性酶（如β-葡萄糖苷酶和酯酶）水解，产生无苦味的化合物。这个过程极其耗时，通常需要大约3-6个月。可以通过添加氢氧化钠（NaOH）溶液处理数小时（碱液脱苦或西班牙式）来消除或至少减轻天然苦味，使产品适合人类食用。强碱可以渗透橄榄肉，促进橄榄苦苷的快速水解，产生羟基酪醇等无苦味化合物。然而，碱液处理会导致橄榄质构变化，降低其硬度，并需要后续多次水洗以去除橄榄肉中的NaOH，产生大量高污染废水，引发环境担忧。
材料与方法
本研究使用Konservolia品种的食用青橄榄（希腊阿姆菲萨产），处于成熟早期阶段（浅绿色果肉）。橄榄于2021年10月采摘，并立即运至实验室。储存于7°C下，使用前用自来水冲洗。
实验设计包括三个不同的脱苦过程：1）传统脱苦：在酸化（用CH3COOH调节pH至5.5）的盐水（8% w/w NaCl；橄榄:盐水=1:1）中浸泡8周。2）高压辅助脱苦：在100、250和400 MPa压力下处理5分钟和20分钟，然后在酸化盐水（8% w/w NaCl）中浸泡48小时。3）碱液脱苦：在2% NaOH溶液中浸泡8小时。脱苦后，所有样品在酸化盐水（8% NaCl，pH 5）中进行至少六个月的发酵，以评估发酵持续时间和最终产品质量。比较了自然发酵、高压预处理（250 MPa/5 min）橄榄和碱液脱苦橄榄的发酵效果。
高压辅助脱苦与其它技术的比较
总体而言，与传统脱苦技术相比，高压处理能在极短时间内实现橄榄脱苦。在最强烈的处理条件下（400 MPa，20分钟），橄榄苦苷含量在处理后立即减少了高达80%（降至2.88 mg/100 g d.m.），而初始含量为54.94 mg/100 g d.m.
。高压瞬时诱导了橄榄细胞膜的机械破坏，导致细胞内化合物提取性更高，并瞬时去除了大部分橄榄苦苷，从而将脱苦时间缩短至数小时。高压处理后，总酚含量也较初始浓度（2.23 mg/g d.m.）下降了30%至57%。提高高压处理强度（压力从100升至400 MPa，时间从5增至20分钟）会导致橄榄苦苷和总酚的提取率更高。
然而，高压本身并非一个独立的脱苦过程，它是作为传统希腊式脱苦程序的预处理步骤。在高压预处理的橄榄于盐水（8% w/w NaCl）中孵育期间，橄榄苦苷含量持续下降，在48小时后含量降至1.06 mg/100 g d.m.以下。在400 MPa的最高压力下，盐水孵育48小时后，橄榄苦苷含量仅为0.25 mg/100 g d.m.。值得注意的是，传统脱苦样品在盐水中浸泡8周后达到的橄榄苦苷含量（1.96 mg/100 g d.m.），高压辅助脱苦技术在不到18小时内即可达到。高压脱苦样品在盐水孵育期间的总酚含量保持稳定，范围在9.15至12.05 mg/g d.m.之间。橄榄脱苦的基本机制包括橄榄苦苷通过内源性酶（如β-糖苷酶和酯酶）的活性水解为其他无苦味化合物，如羟基酪醇。高压导致的细胞破坏增强了零时刻橄榄苦苷和部分总酚的提取，并促进了孵育期间橄榄苦苷向羟基酪醇的水解。这通过脱苦橄榄的羟基酪醇含量得以证实，其在所有研究的高压条件下孵育期间均有所增加。羟基酪醇的初始浓度为0.19 mg/100 g d.m.，由于高压预处理样品的橄榄苦苷水解，增加了约40倍（至7.28 mg/100 g d.m.）。
脱苦橄榄的品质特性
在所有研究技术的脱苦过程中，橄榄的亮度（L值）和黄度（b值）显著降低，而红度（a*值）增加，这主要归因于多酚氧化酶的酶促褐变活性。对于高压脱苦橄榄的颜色参数，不同高压条件之间无显著差异；然而，高压预处理后立即发生了颜色变化，与原始生橄榄相比，ΔE值范围在8.96至13.53之间。在盐水孵育期间，高压脱苦橄榄的颜色在最初的18小时内发生了显著变化（ΔE值范围20-25），之后在长达48小时内几乎保持恒定。对照样品的颜色在孵育期间变化缓慢，在8周后达到ΔE值17.75。更具体地说，生橄榄的初始亮绿色（色度值和色调角值分别为41.90和122.03）在高压处理后立即显著变暗，色度值降低（32.46–38.40）。
高压脱苦橄榄的硬度在处理后立即下降（高达70.4%），而未处理橄榄的硬度为12.6 N
。在盐水孵育的最初24小时内，高压脱苦橄榄的硬度下降更为明显，之后在更长时间内保持恒定。对于250 MPa或更高的压力，零时刻和盐水孵育24小时后的硬度无显著差异。传统脱苦8周后达到了类似的硬度降低（5.19 N，与生橄榄相比下降58.9%）。碱液脱苦橄榄在处理后硬度最低，为2.19 N。关于所有脱苦技术橄榄的感官特性，高压预处理在显著更短的时间内降低了橄榄的苦味强度。高压（≥250 MPa）脱苦样品在盐水孵育仅24小时后即被评为“不苦”。相比之下，传统脱苦橄榄在盐水中浸泡1周后，苦味强度评分为8.5，与其橄榄苦苷含量（108 mg/100 d.m.）相符。在盐水中浸泡8周后，传统脱苦橄榄在苦味方面可被认为是可接受的。橄榄苦苷含量降低与苦味呈正相关，证实了橄榄苦苷水平的降低也导致了苦味评分的降低。
脱苦橄榄的发酵
每种脱苦技术之后都进行了发酵步骤。食用橄榄的发酵在酸化（pH 6）的盐水（8% w/w NaCl）中进行，持续250天。当pH降至约4.0以下时，发酵被认为结束，产品被认为是安全的。总共研究了四个不同样品：自然发酵、高压250 MPa预处理发酵、高压400 MPa预处理发酵和碱液发酵。
发酵过程中种群动态与pH变化
自然发酵是一个自发的复杂过程，其中预先存在于橄榄中的内源性微生物群的活动影响并塑造了最终发酵食用橄榄的品质特性和感官特征。初始盐水中NaCl浓度为8%（w/w），初始pH为6.2，发酵温度设定为25°C。这些参数对发酵进程至关重要，确保只有乳酸菌或酵母生长，避免导致腐败的不良微生物生长。自然发酵的初始乳酸菌、酵母/霉菌和肠杆菌科负载分别为4.12、5.72和3.28 log CFU g
-1。在自然发酵期间，扩散现象缓慢，因此微生物生长，进而发酵进程被延迟。总活菌数的初始数量约为6.0 log CFU g
-1，随后在发酵的前14天增加，而在46天后观察到下降。这种减少可能与发酵30天后盐水的低pH有关。在自然发酵的初始阶段，乳酸菌和酵母共存并开始出现。在发酵的最初14天后，乳酸菌占据主导，平均负载为6.34 log CFU g
-1
。pH在发酵过程中也显著下降，在101天后达到4.25的值，这是由于乳酸菌产生的乳酸所致。酵母和霉菌的负载在发酵过程中持续下降。在101天后，其种群为3.38 log CFU g
-1。肠杆菌科种群在整个发酵期间低于3.0 log CFU g
-1。
对于碱液脱苦，盐水的初始pH高于自然发酵期间观察到的值。由于这种高初始pH，优势微生物是肠杆菌科，在发酵初始阶段负载为7.02 log CFU g
-1。相应的乳酸菌和酵母/霉菌初始负载分别为3.85和5.48 log CFU g
-1。碱液发酵的初始阶段通常以高浓度的肠杆菌科为特征，当盐水的pH降至6以下时，其数量会减少。在碱液发酵30天后，观察到肠杆菌科种群显著减少，伴随着pH下降，有利于乳酸菌的定植。乳酸菌负载在发酵28天后达到7.04 log CFU g
-1。碱液发酵的最后阶段以乳酸菌的快速生长和pH趋于达到4左右为特征。乳酸菌群落在140天后减少，因为发酵底物耗尽。pH持续下降，在248天后达到4.2的值，显著高于相同时间内其他发酵的相应值
。
在高压辅助脱苦的情况下，结果显示高压技术没有影响乳酸菌和酵母/霉菌的负载。高压引起橄榄细胞膜的改变，导致传质现象增强。细胞内营养物质在盐水中的提取比自然发酵过程更有效和快速，由于盐水中营养物质的丰富，促进了乳酸菌和酵母/霉菌的生长。然而，高压预处理促进了酚类化合物（特别是橄榄苦苷及其水解衍生物）瞬间释放到盐水中，这些物质因其抗菌和抗氧化活性，在发酵早期阶段抑制了乳酸菌的生长。因此，在高压400 MPa发酵开始时，乳酸菌的生长比自然发酵和高压250 MPa发酵慢。高压250 MPa发酵是最快的，这是由于高乳酸菌生长速率，得益于从橄榄中提取的营养物质富集了盐水。尽管在更强烈的高压条件下乳酸菌生长略有延迟，但两种高压预处理橄榄发酵期间的pH下降无显著差异，表明总体发酵持续时间未受影响。pH监测显示高压预处理有明显的积极效果。对照、高压250 MPa预处理、高压400 MPa预处理和碱液预处理样品的盐水pH分别在约101、46、42和250天的发酵后降至4.2以下。pH低于4.5的盐水可抑制酸敏感细菌的生长，并避免发酵和储存期间病原体的发展。高压预处理样品的pH下降更快。因此，可以得出结论，不同的压力（250和400 MPa）不影响酸化动态和可培养微生物群的生长。
发酵期间食用橄榄的品质参数
在最终发酵橄榄的品质特性方面未观察到显著差异。高压预处理后立即观察到色度值和色调角降低。色度值的降低归因于多酚氧化酶活性。高压处理破坏了细胞内细胞器，导致多酚氧化酶释放并随后与其酚类底物接触，从而加速了氧化反应。在每种发酵结束时，所有最终发酵橄榄的色度值范围约为21.43至26.07。最终发酵橄榄呈暗绿色，对应的色调角等于73.6–74.3°。
碱液脱苦作为预处理步骤导致橄榄硬度值下降最大，在发酵结束时硬度约为2.3 N。高压处理显著降低了处理后橄榄的硬度，但与自然发酵橄榄相比，发酵步骤结束时未观察到显著差异。这表明，尽管高压最初软化了橄榄，但发酵后最终质地得以保留，保持了产品质量。关于感官评价，所有发酵橄榄在每种发酵结束时，在总体印象、风味和外观方面得分相同。也评估了苦味强度。苦味归因于橄榄中未水解的橄榄苦苷的存在。自然发酵橄榄的苦味强度在大约发酵前28天后是可接受的。在其他三种发酵中，苦味强度从发酵第一天起就在可接受范围内，因为不同的预处理在几小时内加速了脱苦过程。
最优高压辅助脱苦条件的选择
加速脱苦过程的最佳高压条件选择基于：在尽可能短的时间内最大程度降低橄榄苦苷含量、对橄榄品质影响最小、以及在苦味方面的最大感官接受度。作为脱苦步骤，高压（250和400 MPa，5分钟）预处理都显著加速了发酵步骤。选定的高压条件为250 MPa和5分钟，室温下进行，这些条件比400 MPa更温和。在这些高压条件下，促进了橄榄苦苷水解，生产出高质量最终产品，同时将脱苦步骤缩短至仅24小时，发酵步骤缩短至41天。
结论
本研究结果证实，高压加工是食用橄榄预处理的有效技术，可加速其脱苦阶段。可以选择250 MPa和5分钟作为最佳高压条件，依据是：在24小时内降低橄榄的橄榄苦苷含量；由于提取的营养物质丰富，促进盐水中乳酸菌生长，且不影响发酵启动；与自然发酵相比，发酵持续时间缩短一半；最终发酵食用橄榄的高品质。因此，高压作为脱苦步骤的应用被认为具有很高的潜在效益，可最大限度地减少食用橄榄的脱苦时间和发酵持续时间，同时限制碱液的使用，这是工业的一个主要缺点。这些发现与食用橄榄生产商和食品加工业直接相关，他们可以考虑实施高压技术来加速发酵。高压辅助脱苦的主要优势包括其极低的能源需求和环境可持续性，因为它减少了加工时间，同时保持了产品质量。高压加工是一种新兴的食品技术，已成功扩大到工业应用。然而，必须承认某些局限性。高压设备的初始投资成本高，需要进行仔细的技术经济评估，以确定时间节省是否合理。此外，需要对加工条件进行优化，并适应现有生产线，以实现工业规模的一致结果。尽管有这些考虑，高压技术代表了一种有前途的、可持续的加速食用橄榄发酵的方法，在环境与运营效率同高质量产品成果之间取得了平衡。
