《Sustainable Food Technology》：Chitosan based ecofriendly nanoencapsulation formulation of Clitoria ternatea extract coated bacterial probiotic strain Lactobacillus acidophilus: a sustainable approach to improve probiotic functionality, stability, and tolerance
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本文推荐一项创新的可持续生物技术研究。作者成功构建了一种基于壳聚糖（CS）与蝶豆花（Clitoria ternatea， CT）提取物包覆的益生菌乳酸杆菌（Lactobacillus acidophilus， LA）纳米胶囊（CT-CS-LA-NC）。该体系展现出高达98.43%的包封率（EE），显著增强了益生菌在模拟胃肠道酸性（pH 2.5/3.5）及胆盐环境下的存活率与长期贮藏稳定性（4°C下28天），并兼具优异的抗氧化（DPPH自由基清除活性48.2%）与抗菌（针对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌）性能。分子对接揭示了其与肠道相关蛋白（如O-GlcNAcase， S-layer蛋白）的强结合力。这项工作为开发环境友好、高效稳定的功能性食品与营养制剂提供了有前景的解决方案。
引言
食品腐败是影响制造商经济与品牌声誉的重要问题，食品工业也正在寻求传统防腐剂的替代品。益生菌，特别是乳酸菌和双歧杆菌，作为生物防腐剂被用于创造健康安全的食品产品。当摄入足量时，它们能为宿主带来健康益处，其作用机制包括竞争性抑制有害菌定植、增强肠道屏障、产生抗菌物质以及调节免疫系统等。然而，益生菌要发挥功效，必须能够耐受胃部的酸性环境和肠道中的胆汁，并在储存期间保持活性。因此，提高益生菌在加工、储存和胃肠道传输过程中的稳定性是至关重要的挑战。
在众多益生菌中，乳酸杆菌（Lactobacillus acidophilus）因其有益特性而被广泛研究。为了有效递送并保护这类益生菌，包封技术应运而生。包封可以将活性成分包裹在基质中，保护其免于降解，改善材料处理性，并增强稳定性。在众多包封材料中，海藻酸盐因其成本低、无毒、生物相容性好而被广泛应用，但其在酸性环境下的稳定性不足。用壳聚糖（Chitosan， CS）涂层海藻酸盐微珠可以增强包封益生菌的稳定性和活力。壳聚糖是一种天然生物聚合物，具有生物可降解性、抗菌性和成膜能力。
与此同时，植物提取物因其丰富的生物活性成分而受到关注。蝶豆花（Clitoria ternatea， CT）富含抗氧化剂、类黄酮和酚类化合物，具有抗菌特性。将CT提取物与壳聚糖结合用于益生菌的纳米包封，有望协同提升包封体系的稳定性、生物利用度及功能活性。然而，关于CT提取物在壳聚糖-海藻酸盐基纳米包封中用于益生菌稳定化及其生态毒性评估的研究报道尚不充分。
基于此，本研究旨在开发一种可持续的纳米包封配方，将蝶豆花提取物包被的益生菌乳酸杆菌封装于纳米级壳聚糖基质中，形成CT-CS-LA-NC纳米胶囊，以系统评估其对益生菌功能性、稳定性及耐受性的提升效果。
材料与方法
本研究使用的益生菌菌株乳酸杆菌（L. acidophilus）从当地采购的鲜制酸奶中分离得到。通过形态学（革兰氏染色、孢子测试、运动性测试）、生物化学（吲哚产生试验、过氧化氢酶试验）和分子特征（16S rRNA测序）对分离菌株进行鉴定，确认其为L. acidophilus，其16S rRNA基因序列已存入NCBI GenBank（登录号PX470079）。
蝶豆花提取物的制备通过将花瓣在水中均质并浸提72小时，随后过滤并旋转蒸发浓缩得到。植物化学定性分析表明提取物中含有生物碱、类黄酮、酚类、单宁等活性成分。
CT-CS-LA-NC纳米胶囊的制备采用简单的原位分散法。将含有1.2%海藻酸钠、CT提取物和乳酸杆菌悬浮液的混合物，逐滴滴入含有氯化钙（CaCl2）和吐温20的溶液中，形成微珠。液滴在氯化钙溶液中浸泡30分钟以固化，随后取出、洗涤并表面干燥，最终获得不透明的球形纳米胶囊。
通过计算包封前后活菌数的比值来评估包封效率。使用动态光散射（DLS）分析颗粒尺寸和多分散指数（PDI），Zeta电位分析仪评估胶体稳定性。利用扫描电子显微镜（SEM）观察表面形貌，傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析功能基团及分子间相互作用，热重分析（TGA）评估热稳定性。
功能活性评估包括：
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抗氧化活性：采用DPPH自由基清除实验，测定不同浓度样品的自由基清除率，并计算半数抑制浓度（IC50）。
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抗菌活性：通过琼脂扩散法，测试纳米胶囊及其分泌物对大肠杆菌（Escherichia coli）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的抑制效果。
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酸耐受性：将游离乳酸杆菌和CT-CS-LA-NC置于pH 2.5和3.5的模拟胃液中，分别在12、24、36小时后测定存活率。
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胆盐耐受性：在含有0.3%胆盐的MRS肉汤（pH 7.5）中，于相同时间点评估益生菌的存活情况。
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贮藏稳定性：将样品置于4°C冷藏，分别在7、14、21、28天时测定活菌数，评估其储存期间的活性保持能力。
生态毒性评估通过种子发芽实验进行，用CT-CS-LA-NC处理黑豆（Vigna mungo）种子，观察其对发芽率的影响，并通过SDS-PAGE分析处理组与对照组种子蛋白质表达的差异。
分子对接分析使用CB-Dock软件进行，探讨了纳米胶囊中的关键配体（花青素、乳酸、壳聚糖）与两个肠道相关靶点蛋白：O-GlcNAcase（PDB: 7K41）和S-layer相关蛋白（SlpA， PDB: 8AE1）之间的结合亲和力。
结果与讨论
1. 纳米胶囊的制备与表征
成功制备了CT-CS-LA-NC纳米胶囊。包封效率高达98.43%，表明包封过程能有效保护益生菌细胞。DLS分析显示，纳米胶囊的Z-平均粒径为162 nm，平均直径为91.1 nm，处于纳米尺度，有利于靶向递送。Zeta电位为-54.7 ± 0.32 mV，表明颗粒表面带有高负电荷，胶体分散体系静电稳定性强，能有效防止聚集。
SEM图像显示，纳米胶囊表面形貌相对光滑、均匀，呈不规则的球形颗粒，平均尺寸约为5 μm，表明壳聚糖、益生菌和植物提取物之间形成了复合结构，封装过程高效。FTIR光谱分析证实了各组分间存在强烈的分子相互作用。与纯壳聚糖对照相比，CT-CS-LA-NC的光谱出现了对应于CT提取物和乳酸杆菌中有机化合物（如脂质、蛋白质）的特征峰，并且特征峰（如C-O/C-N伸缩振动峰）发生了位移，这证明了植物提取物和益生菌被成功封装并稳定整合到壳聚糖基质中。TGA分析表明，纳米胶囊具有良好的热稳定性，在升温过程中经历了多个失重阶段，与纯壳聚糖相比，纳米包封延缓了材料的热降解。
2. 增强的生物活性
抗菌活性测试显示，CT-CS-LA-NC及其分泌物对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌均表现出显著的抑制作用。其中，纳米包封的乳酸杆菌及其分泌物的抑菌圈最大，分别达到14.2 ± 0.26 mm 和 14.3 ± 0.27 mm（针对大肠杆菌），以及15.1 ± 0.24 mm 和 14.4 ± 0.32 mm（针对枯草芽孢杆菌），效果均优于游离的乳酸杆菌。这表明纳米包封不仅保护了益生菌，还可能促进了其抗菌物质的产生或释放。
抗氧化活性方面，CT-CS-LA-NC在所有测试浓度下均表现出最高的DPPH自由基清除能力。在1000 μg mL-1浓度下，其清除率达到48.2 ± 1.32%，显著高于游离乳酸杆菌细胞（16.75 ± 0.98%）。其IC50值为28.04 μg mL-1。这种抗氧化能力的增强归因于蝶豆花提取物中富含的花青素和酚类化合物与壳聚糖、益生菌的协同效应。
3. 显著提升的胃肠道耐受性与贮藏稳定性
在模拟胃液的酸耐受性测试中，CT-CS-LA-NC展现出了卓越的保护作用。在pH 2.5条件下处理36小时后，纳米包封细胞的存活率高达60.93 ± 0.68%（2.5 mL剂量），而游离细胞的存活率仅为21.29 ± 0.13%。在pH 3.5条件下，36小时后的存活率也达到76.46 ± 0.60%，同样优于游离细胞。这表明壳聚糖基质为益生菌提供了有效的物理屏障，缓冲了酸性环境对细胞的直接损伤。
在模拟肠道胆盐耐受性测试中，纳米包封的优势同样明显。处理36小时后，在2.5 mL剂量下，CT-CS-LA-NC的存活率为39.46 ± 0.68%，而游离细胞仅为21.29 ± 0.13%。尤其在24小时和36小时的长时间暴露下，纳米包封细胞的存活率在所有测试浓度下均显著高于游离细胞，证明了其缓释特性和对胆盐侵蚀的持久保护能力。
贮藏稳定性研究结果令人鼓舞。在4°C冷藏28天后，游离乳酸杆菌的活菌数迅速下降。相比之下，CT-CS-LA-NC包封的细胞在储存7天后仍保持了94%的活性，即使在28天后也保留了超过一半（52%）的初始活菌数。这凸显了该纳米包封体系在延长益生菌产品货架期方面的巨大潜力。
4. 良好的环境相容性与分子作用机制
生态毒性评估显示，用5% CT-CS-LA-NC处理的黑豆种子，发芽率达到96.81%，与对照组（98%）无显著差异，且对幼苗生长有促进作用。SDS-PAGE蛋白质谱分析也未发现处理引起种子蛋白质表达的异常毒性变化。这表明所开发的纳米胶囊对环境友好，生态风险低。
分子对接分析从理论上揭示了该体系发挥作用的潜在分子机制。关键配体花青素与两个靶点蛋白（O-GlcNAcase和SlpA）表现出极强的结合亲和力，结合能分别为-9.4 kcal mol-1 和 -9.6 kcal mol-1。壳聚糖和乳酸也与这些蛋白有显著的相互作用。这些强烈的结合作用可能有助于稳定益生菌细胞、调节肠道相关酶活性，或影响益生菌与宿主肠道的粘附，从而从分子层面解释了纳米包封体系增强益生菌功能性和稳定性的协同效应。
结论
本研究成功开发并系统评估了一种基于壳聚糖和蝶豆花提取物的乳酸杆菌纳米包封体系（CT-CS-LA-NC）。该体系不仅实现了高达98.43%的包封效率，还显著增强了益生菌在严苛的模拟胃肠道环境（低pH、胆盐）中的存活能力，并大幅延长了其在冷藏条件下的贮藏稳定性。此外，该纳米胶囊还兼具优异的抗菌和抗氧化性能。生态毒性评估证实其环境友好，分子对接研究则从理论层面揭示了其组分与肠道靶点蛋白的强相互作用。这项工作为开发下一代具有增强稳定性、靶向递送和多重健康益处的功能性食品、饮料和营养补充剂提供了一种创新、可持续且高效的解决方案，符合当前食品工业对天然、绿色、功能性配料日益增长的需求。
