《Molecular Oral Microbiology》：Random Mutagenesis in Porphyromonas gingivalis Enables Isolation of Mutants With Enhanced Secreted Protease Activity
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本研究通过建立一种基于酪蛋白琼脂（GCH）的筛选方法，成功从化学诱变剂（2,6-DAP或EMS）处理的牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）中分离出4株分泌蛋白酶活性增强的突变菌株。全基因组测序分析表明，2,6-DAP诱变株的突变位于铁转运相关基因，其蛋白酶活性增强可能与铁限制诱导的rgpA转录上调有关；而EMS诱变株则携带有多个突变，其中包括在关键蛋白酶基因rgpA催化域内发现的G450D和C600Y突变。这项工作为深入研究牙龈蛋白酶（gingipains）的功能、调控及致病机制提供了高效的工具和分子基础。
材料与方法
本研究以牙周炎关键致病菌牙龈卟啉单胞菌（P. gingivalis）ATCC 33277野生型菌株为出发菌株。研究旨在通过随机诱变筛选获得分泌蛋白酶活性增强的突变体。实验中使用2,6-二氨基嘌呤（2,6-DAP）或甲基磺酸乙酯（EMS）作为化学诱变剂处理细菌，以引入随机点突变。为了高效筛选高活性菌株，研究者专门开发了GCH酪蛋白琼脂培养基，该培养基以酪蛋白钠为主要蛋白源。在该培养基上，随着菌落生长，其分泌的蛋白酶会降解周围培养基中的酪蛋白，初期形成不透明区域，随着降解的深入，不透明区域可被进一步分解，在菌落周围形成透明晕圈。透明晕圈的出现时间与蛋白酶活性强弱相关，从而提供了一种基于表型的可视化筛选方法。经诱变处理的细胞被涂布于GCH平板上，筛选那些相比野生型能更早形成透明晕圈的菌落作为候选菌株。
随机诱变与高蛋白酶活性菌株的筛选
在GCH平板上，菌落大约在涂布6天后可见。培养基初始是透明的，随着菌落生长，酪蛋白被部分降解并沉淀，导致培养基变得不透明。继续培养后，部分菌落周围的不透明区域会逐渐变透明，形成清晰的晕圈。这些比野生型更早形成晕圈的菌落被选为候选的高蛋白酶活性菌株，用于后续分析。
分泌蛋白酶活性的测定
候选菌株在mGAM培养基中培养至对数生长中期，收集培养上清液，并使用Red Protease Detection Kit定量测定蛋白酶活性。活性值均一化至OD600= 1.0，并与平行测定的野生型活性进行比较。结果显示，共有四株突变菌株（m017, m024, m060, m072）的蛋白酶活性高于野生型，至少达到野生型的1.2倍。其中，m017和m024由2,6-DAP诱变得来，而m060和m072则由EMS诱变得来。
突变位点的鉴定
对四株高活性突变菌株和野生型菌株进行全基因组测序。序列比对分析显示，2,6-DAP来源的突变菌株（m017和m024）各携带一个突变，分别位于铁离子转运相关基因feoB和能量转导蛋白TonB编码基因tonB上。这表明其蛋白酶活性增强可能源于铁摄取功能受损导致的细胞内铁限制，进而上调了rgpA基因的转录，最终增加了蛋白酶（主要是RgpA）的分泌量。EMS来源的突变菌株（m060和m072）则携带多个突变。值得注意的是，在m060菌株中检测到一个位于rgpA基因催化结构域（第450位氨基酸）的G450D突变。在m072菌株中，检测到一个位于rgpA基因催化结构域（第600位氨基酸）的C600Y突变。这些突变直接发生在关键的蛋白酶基因上，可能改变了RgpA蛋白酶的内在酶活性。此外，在m060菌株中还鉴定出与Type IX分泌系统（T9SS）核心组分SprA（Sov）以及Type I分泌系统（T1SS）TolC家族蛋白相关的基因突变，这些突变可能通过影响蛋白分泌效率，间接贡献于蛋白酶活性的表型增强。在m072菌株中，还发现了与次要菌毛亚基Mfa5相关的基因突变，该蛋白参与细胞表面结构组成，其突变可能通过影响细胞表面结构或T9SS功能来间接调控蛋白酶的分泌。
讨论与结论
本研究成功建立了一种基于酪蛋白琼脂培养基的高效筛选方法，可从随机诱变的牙龈卟啉单胞菌文库中分离出分泌蛋白酶活性增强的突变体。该筛选系统不仅能检测到因酶活性本身改变（如rgpA催化域突变）导致的活性增强，也能检测到因调控或分泌过程改变（如铁摄取基因突变、分泌系统相关基因突变）导致的胞外蛋白酶水平升高。通过全基因组测序，研究者将表型与基因型关联起来，揭示了两种不同的活性增强机制：一是通过铁限制间接上调蛋白酶表达；二是通过直接改变RgpA蛋白酶催化域的氨基酸序列。此外，在EMS诱变株中发现的分泌系统（T9SS、T1SS）及细胞表面结构（Mfa5）相关基因的突变，提示蛋白酶的分泌效率和释放过程也是影响胞外活性的重要因素。这项工作为深入理解牙龈卟啉单胞菌主要毒力因子——牙龈蛋白酶（gingipains）的活性调控、分泌机制及致病机理提供了新的研究工具和分子线索，未来或可应用于发现新型蛋白酶抑制剂或分泌系统抑制剂。
