《International Journal of Oral Science》：Bioengineered α-Hairpin peptide TKH with GKG linker: a LLPS-mediated biomimetic mineralization system for intrafibrillar remineralization and deep dentin tubule occlusion
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本工作通过将柔性GKG连接子引入α-螺旋模板，设计出新型α-发卡肽TKH，并系统分析了其液-液相分离（LLPS）与自组装特性。研究表明，TKH可有效稳定无定形磷酸钙（ACP），促进胶原纤维内的纤维内矿化，并通过LLPS介导的肽自组装、羟基磷灰石（HA）吸附及ACP稳定化，实现牙本质小管（DTs）的深层封闭与优异生物安全性，为牙本质过敏症（DH）的治疗提供了创新的肽基生物材料策略。
GKG连接子促使α-螺旋肽在计算机模拟中形成α-发卡结构
TKH的设计策略基于对自组装弹性蛋白样肽ELP16的结构分析。研究人员选取了6种长度在11至37个氨基酸之间的α-螺旋肽，通过计算机模拟评估GKG连接子对其结构的影响。模拟结果显示，引入GKG连接子能使这些肽在计算机模型中形成具有螺旋-转角-螺旋拓扑结构的α-发卡构象。
具有LLPS倾向的α-发卡肽TKH展现出显著的自组装行为
分析型高效液相色谱和质谱证实了TKH肽的成功合成，其纯度达92.83%，分子量为4882.40 Da，与理论值4881.83 Da相符。圆二色光谱显示，在SDS溶液中，TKH在208 nm和222 nm附近出现两个特征性负吸收带，并在195 nm附近有一个正吸收带，表明其呈现典型的α-螺旋构象。而在PBS中，TKH的谱图在200 nm附近显示一个宽泛的负吸收带，提示其主要采取无规卷曲构象。这种环境依赖的构象转变表明，PBS可能促进TKH分子间相互作用和部分肽的聚集，从而形成动态凝聚体，这与前述的LLPS结果相符。
由于LLPS是肽自组装的关键途径，在磷酸盐诱导条件下，通过共聚焦激光扫描显微镜观察到了TKH肽溶液中液滴的形成。荧光漂白恢复实验进一步验证了这些凝聚体的动态特性：对罗丹明6G标记的TKH液滴内一个2 μm圆形区域进行选择性光漂白后，荧光在20秒内迅速恢复至原始值的约87.2%。标记的TKH分子在液滴内部保持高度流动性，证实了这些凝聚体维持着类液体的内部环境，而非静态聚集体。这种快速的分子交换是LLPS衍生组装的典型特征。通过浊度法获得了TKH在不同浓度下的部分相图，表明了TKH的LLPS倾向及其自组装特性研究的必要性。
透射电子显微镜观察显示，TKH和TVH-19肽均能形成平均直径约50 nm的球形纳米颗粒。硫磺素T荧光强度随TKH浓度增加而增强，且在相同浓度下显著高于TVH-19，表明TKH在较高浓度下具有更强的自组装倾向。当用380 nm波长激发并在400-580 nm范围扫描发射光谱时，TKH在480 nm处显示出更强的荧光峰。廷德尔效应强度与肽自组装程度呈正相关。在激光照射下，即使浓度低至3.125 μmol/L，TKH也表现出清晰的廷德尔效应，而TVH-19在50 μmol/L时才可观察到，这共同证实了TKH优越的自组装能力。
自组装肽在结构修饰后保留抗菌活性和生物膜抵抗性
结晶紫染色表明，在20 μmol/L浓度下，TKH和TVH-19均能显著减少变形链球菌生物膜的形成。pH下降实验揭示了阴性对照组与肽处理组之间不同的产酸动态。阴性对照组在30分钟内pH从7.0迅速降至约4.5，随后进入平台期，反映了此期间变形链球菌生物膜旺盛的产酸活动。两种肽的添加均导致所有处理组的pH下降更为平缓，并在约3小时后趋于稳定。这种延迟的酸化模式表明，即使在低浓度下，两种肽也能有效抑制变形链球菌生物膜的代谢活性。
自组装肽的吸附能力促进胶原和脱矿牙本质的体外再矿化
采用等温滴定量热法定量表征了TKH肽与I型胶原的相互作用。典型的热谱图显示，随着连续注射，放热峰逐渐减小，表明TKH与胶原之间的结合过程是强放热的。结合等温线的拟合得到了解离常数Kd= 3.52 × 10?7M，证明了TKH与胶原之间的高结合亲和力。显著的负焓变和负熵变表明相互作用主要由氢键和静电引力驱动，而负熵变反映了系统有序度的增加，暗示了复合物形成时界面水分子的结构有序化或重组。计算得到的吉布斯自由能变ΔG = ?36.8 KJ/mol为负值，证实结合过程是热力学自发的。集成的ITC等温线显示出清晰的S形饱和曲线，采用单位点结合模型拟合得到的化学计量数N = 1.65，表明大约两个TKH分子与每个胶原结合单元相互作用，符合强且特异性的放热结合。
傅里叶变换红外光谱显示了肽在牙本质表面的吸附情况。在脱矿牙本质表面涂覆TKH肽后，以下特征峰显著增加：酰胺N-H伸缩振动、酰胺I带、酰胺II带、PO43?官能团。这些光谱变化表明肽在HA表面或暴露的胶原基质上有大量保留。用去离子水清洗后，TKH的特征峰与TVH-19相比仅略有减少，表明TKH与牙本质胶原基质具有更好的结合亲和力。
通过BCA法检测了肽在HA颗粒上的吸附量。与HA颗粒混合后，TKH-HA和TVH-19-HA组的上清液中未结合肽浓度均显著降低。超过80%的两种肽被吸附到HA颗粒上，确认了它们对HA的高亲和力。即使在不与HA颗粒混合的情况下，未结合的TKH肽浓度也出现下降，这可能是由于TKH在溶液中自组装成更大的分子，导致离心后部分沉降。
在钙磷稳定实验中，不含任何稳定剂的对照组出现明显浑浊，显微镜下可见CaP沉积物。相反，50 μmol/L的TKH肽能有效稳定悬浮液，孵育24小时后溶液澄清。即使在离心后，显微镜下也未检测到CaP形成。TVH-19肽在400 μmol/L浓度下达到类似的稳定效果，表明TKH具有优异的稳定钙和磷酸盐的能力。
胶原矿化5天后，去离子水组内的胶原纤维未发生矿化，仅表面有磷灰石晶体沉积。PAH组显示出纤维内矿化，其特征是出现了周期性带状图案。TKH组表现出最有效的纤维内矿化，矿物质沿胶原纤维长轴有序排列，并显示出典型的周期性带状图案。同时也观察到了纤维外矿物沉积。TVH-19组的大部分同质矿物存在于纤维外部，周期性带状图案稍显逊色。
体外再矿化循环后的截面扫描电镜显示，与完整牙本质表面相比，EDTA蚀刻的牙本质其牙本质小管明显扩大。EDS分析显示牙本质表面钙和磷含量显著减少，小管内几乎无分布。PBS组再矿化4周后，牙本质小管保持开放，无矿物颗粒沉积。NaF组和TVH-19组均表现出部分堵塞小管的矿物沉积，同时钙和磷分布增加。值得注意的是，经TKH处理的牙本质显示出广泛的矿物生长，尤其是在小管周围区域，再生的矿物颗粒堵塞了小管。钙和磷含量增加且分布更均匀，其钙磷比接近完整牙本质。纵截面SEM进一步显示，PBS组胶原纤维明显暴露，未观察到再矿化沉积物。在NaF和TKH组中，牙本质小管内可见清晰且均匀的矿物结晶，与PBS组相比，钙和磷含量显著增加。而在TVH-19组，部分矿物沉积物覆盖了胶原纤维表面，使其难以辨别。XRD图谱显示，与健全牙本质相比，EDTA蚀刻组和PBS组在2θ = 25.8° 、31.9° 、32.1° 和32.8° 处的衍射峰减少且变宽。相比之下，经肽处理的脱矿牙本质在这些位置显示出尖锐的衍射峰，表明新形成的晶体主要是羟基磷灰石。
自组装肽在体内表现出优异的牙本质再矿化效果
为评估TKH和TVH-19肽在口腔条件下的再矿化功效，建立了使用人牙本质切片的高体动物模型。将酸蚀的牙本质样本固定于Sprague-Dawley大鼠的腭表面以模拟口腔环境。治疗28天后，SEM图像显示，PBS组的牙本质小管保持开放，胶原纤维暴露，未观察到明显的矿物沉积。NaF组形成了相对均匀致密的矿化层。值得注意的是，TKH和TVH-19处理组在横截面上均显示出广泛的矿物沉积，从而有效堵塞了牙本质小管。纵向观察进一步表明，即使是深部的牙本质小管也被矿物沉积物均匀渗透，且TKH组的小管内矿物排列更为致密，表明其再矿化作用显著。EDS图谱进一步显示PBS组钙和磷分布稀疏。NaF组钙和磷信号显著增强，而TKH组钙和磷分布更均匀，反映了良好的矿化活性，这与体外研究结果一致。此外，生物安全性评估显示，主要器官及与牙本质样本直接接触的口腔黏膜均未出现显著的炎症反应或组织损伤。实验组与对照组之间的血液学参数也未检测到显著差异。
肽吸附与促进再矿化的分子动力学模拟
通过AlphaFold预测了TKH和TVH-19的初始结构。由于羟基磷灰石是牙本质的主要无机成分，且酸蚀牙本质表面主要暴露（010）晶面，因此选择HA（010）表面作为目标模型。肽在HA表面的吸附情况通过顶视图和侧视图展示。在吸附阶段，TVH-19主要通过其带正电的赖氨酸残基与HA表面相互作用，而TKH则通过赖氨酸和精氨酸残基共同吸附，从而在脱矿牙本质表面实现更稳定的附着。
DSSP分析揭示了TVH-19和TKH在吸附和再矿化过程中不同的构象行为。TVH-19保持了相对刚性的结构，仅在末端形成微小的环状结构，表明与HA结合时结构重排有限。相比之下，TKH表现出显著的灵活性，特别是在GKG连接子周围，在维持其整体发卡拓扑结构的同时，频繁地在弯曲和环状状态之间转换。肽与HA相互作用的结合能始终为负值，证实两种肽均可自发吸附到HA（010）表面。
监测了肽与HA质心沿Z轴距离随时间的变化。两种肽均在10 ns内达到稳定吸附，之后质心距离波动变得有限。为评估构象稳定性，计算了均方根偏差和基于残基的均方根涨落。RMSD曲线表明TVH-19在50 ns达到平衡，而TKH更早，约在25 ns达到稳定。RMSF分析显示两种肽末端区域具有较高的柔性，中心残基波动较低。TKH中第二个TVH-19片段的RMSF谱图与游离TVH-19非常相似，这与它们通过赖氨酸和精氨酸残基介导的类似吸附模式一致。
对于矿化模拟，初始结构在加入Ca2+和H2PO4?后，TKH不仅通过赖氨酸/精氨酸残基稳定地将第二个TVH-19吸附在HA上，还通过其第一个TVH-19的带正电残基招募H2PO4?。DSSP显示出与吸附模拟相似的结构变化。相互作用能分析显示，TKH与H2PO4?/HA之间的能量值低于TVH-19，表明TKH与H2PO4?/HA之间的结合亲和力更强。这一发现与之前H2PO4?在诱导肽自组装中起关键作用的结论一致。离子-肽相互作用可能增强了LLPS驱动的TKH聚集，从而提高了其自组装能力。随后对钙离子的吸引促进了ACP前体的形成，并推动矿物质渗透到胶原纤维中。
矿化过程中的质心距离分析显示，TVH-19和TKH的第一个结构域波动较大，而TKH的第二个结构域与HA表面保持了更稳定的接近距离。在引入Ca2+和H2PO4?后，TVH-19的RMSD曲线在整个过程中保持稳定，而TKH的RMSD曲线在大约25 ns后逐渐稳定。这种行为归因于TKH氨基酸残基与离子之间的相互作用。RMSF曲线进一步显示，在矿化条件下，中心残基的柔性与吸附条件相比有所降低，表明构象稳定性增加。
讨论
经典的离子介导晶体成核理论最初被提出来解释骨骼和牙本质中的胶原纤维内矿化。然而，最近关于颗粒介导结晶的研究提出了一种非经典途径，其中预成核簇是通过非胶原蛋白或其类似物螯合钙离子和磷酸根离子形成的。这些预成核簇在NCPs类似物的稳定下聚集成更大的类液体ACP纳米颗粒。随后，这些ACP纳米颗粒渗透到胶原基质的纤维内水区，并通过自组装形成亚稳态晶体相。这种聚合物诱导液体前体被认为是矿物在结晶前渗入胶原纤维的关键过渡状态。LLPS是PILP理论的基础，因为液体或类液体相在固化前呈现柔性形态，这使得矿物质能有效渗透胶原纤维，从而促进纤维内矿化。NCPs或带电聚合物的存在可以在特定条件下稳定ACP并促进类液体前体的形成。这种方法已被广泛用于生成具有非平衡形态的晶体。
值得注意的是，越来越多的证据表明肽自组装也可以通过LLPS进行，这是生物分子自组装的基本机制，与涉及逐步单体添加的经典模型形成对比。均质肽溶液通过LLPS分离成富含溶剂的液相和富含溶质的液滴，代表了自组装前的初始步骤。为了模拟NCPs通过PILP途径驱动ACP渗透胶原纤维的机制，我们专注于同样经历LLPS过程的自组装肽。基于对已报道的自组装肽ELP16的分析，GKG被确定为暴露在肽表面的关键组装基序，这也有助于ELP结构内部的转角构象。具体来说，赖氨酸提供了可与相邻分子形成氢键或配位键的官能团，作为交联剂促进纤维组装。精氨酸使多肽结构更加灵活。同时，其静电相互作用抵消了ELP16分子间的疏水聚集，从而调节肽的自组装。在本研究中，GKG连接子的引入促进了新型螺旋-转角-螺旋α-发卡结构的形成，该结构兼具α-螺旋和β-转角的特征。虽然β-转角结构长期以来被认为是肽自组装及形成纤维或纳米颗粒等高级结构的基础，但我们对TKH的研究结果表明，由GKG连接子调节的α-发卡结构为肽自组装提供了更多可能性。液滴的直接显微镜观察、FRAP验证的分子动力学以及浊度衍生的部分相图共同表明，TKH在含磷酸盐的条件下经历了LLPS，为其后续的自组装行为提供了机制基础。尽管GKG连接子在本研究中显著增强了TKH的LLPS行为，但其作为通用自组装促进基序的普适性仍有待通过圆二色光谱和分子动力学模拟进行实验验证。需要使用不同的肽进行进一步研究，以确认GKG连接子是否在更广泛的肽系统中产生类似效果。
圆二色光谱结果进一步揭示，TKH的构象景观具有强烈的溶剂依赖性，这与报道的两亲性肽行为一致。在先前的研究中，TVH-19在SDS溶液中也采用α-螺旋结构。而TKH在PBS中表现出比TVH-19更显著的结构重组。这种折叠转变在PBS中被进一步放大，其中的PO43?和离子强度可能促进分子间接触和早期聚集，显著提高了肽的自组装能力，这已通过硫磺素T荧光测定和廷德尔效应实验得到证实。
肽的抗菌功效主要取决于其α-螺旋单体构象和正电荷。尽管TKH表现出比TVH-19更弱的抗菌效果，但这种趋势在机制上是合理的。TVH-19在酸性条件下作为单体抗菌肽发挥作用，其两亲性α-螺旋构象有助于破坏细胞膜。相比之下，TKH这种增强的自组装倾向可能会降低其有效单体浓度，并阻碍其插入细菌膜的能力，从而导致抗菌效力降低。然而，这种组装驱动的行为增强了其矿化性能，因为多价相互作用使TKH能够更有效地稳定钙-磷酸盐前体并促进纤维内矿化。因此，单体抗菌活性与组装介导的矿化功效之间的这种权衡应被视为TKH设计的内在属性。
此外，等温滴定量热实验的热力学参数证明了TKH与胶原之间的高亲和力。因此提出，TKH主要通过其带正电的赖氨酸/精氨酸残基与I型胶原相互作用，与胶原表面的羧基和羟基形成多个氢键和静电连接。这种相互作用可能在分子水平上稳定了TKH在胶原纤维上的吸附，为后续肽液滴积累和纤维内矿物成核提供了有利的局部环境。MD分析表明，TKH中更多的氨基酸残基参与了对HA表面的吸附，相互作用能的降低进一步证实了TKH与HA之间高度的结合稳定性。在脱矿牙本质表面的吸附实验中，FTIR分析显示TKH在牙本质表面表现出更稳定的吸附行为，这与MD模拟结果一致。对羟基磷灰石和脱矿牙本质表面暴露胶原的吸附能力是TKH应用于牙本质再矿化的基础。
增强的自组装能力使TKH能够稳定钙和磷，这与生理条件下NCPs介导的纤维内矿化过程相一致。在胶原纤维再矿化实验中，TKH在较低浓度下诱导了显著的纤维内矿化，与去离子水组和TVH-19相比，其纤维外矿物成核较少。因此，TKH组在胶原纤维内显示出清晰的周期性带状图案，表明矿物沉积组织有序。这归因于TKH稳定胶原纤维外的钙和磷酸根离子、促进ACP前体形成的能力，并通过自组装成聚电解质样的带电大分子结构，维持胶原纤维内外的渗透平衡和电中性，从而促进ACP渗入纤维内间隙，实现纤维内矿化。此外，再矿化过程的MD模拟揭示了TKH与H2PO4?之间存在强烈的吸引相互作用，证实了其在ACP稳定和增强再矿化中的作用。这些计算结果与在脱矿牙本质模型中观察到的显著再矿化效果非常吻合。总之，这些结果表明TKH可能通过LLPS、自组装以及钙磷离子稳定所介导的唐南平衡机制促进纤维内矿化。
基于其对脱矿牙本质表面的强吸附能力以及诱导I型胶原纤维内矿化的能力，TKH在体外脱矿牙本质模型中展示了有效的矿化诱导作用。经TKH再矿化处理后，EDS在牙本质表面观察到了钙和磷的沉积，牙本质小管内也明显有矿物沉淀。XRD分析进一步证实了羟基磷灰石衍射峰的存在。最后，TKH即使在体内口腔更复杂的环境下也表现出良好的生物安全性和矿化诱导效果。总之，本研究通过策略性地引入柔性GKG连接子，成功设计了一种新型α-发卡肽TKH。该设计显著增强了其LLPS和自组装能力，促进了高效的仿生矿化过程，该过程模拟了非胶原蛋白的功能。尽管临床疗效和详细机制需要进一步验证，但TKH已通过有效促进纤维内再矿化、实现深层牙本质小管封闭以及其固有的抗菌特性，显示出其治疗潜力。该肽系统建立了一种新的仿生策略，将牙本质的治疗范式从被动修复转变为主动再生。
