《FEBS Open Bio》：YlmG1 is localized exclusively to the chloroplast envelope membrane and is involved in preprotein translocation in Arabidopsis thaliana
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本论文通过精密的生化实验，首次在拟南芥中确定了YlmG1蛋白定位于叶绿体被膜，而非先前报道的类囊体膜。研究揭示了YlmG1虽非TIC（叶绿体被膜内侧转位子）复合体的稳定组分，但其在与前体蛋白-转位中间体复合物的结合过程中，会与其他TIC组分一起被招募。结合对莱茵衣藻TIC结构的研究，本文提出YlmG1可能在蛋白质跨叶绿体内被膜转运过程中扮演类似“守门人”的关键角色，为确保前体蛋白的正确分选和转运提供了新的分子见解。
YlmG1在拟南芥叶绿体被膜中的精确定位
在绿色植物谱系中，绝大多数叶绿体蛋白由细胞核基因编码，在细胞质中合成为带有转运肽的前体蛋白，随后依次穿过叶绿体的外被膜和內被膜，该过程分别由TOC（外膜转位子）和TIC（内膜转位子）复合体介导。近年来，对莱茵衣藻TIC复合体的结构生物学研究揭示了一个额外的YGGT家族膜蛋白YlmG的存在，其拟南芥同源物YlmG1是植物生存所必需的蛋白。然而，此前有研究报道YlmG1是参与类囊体膜上类核分布的蛋白，这使其是否参与叶绿体蛋白输入成为一个悬而未决的问题。本研究旨在重新探究YlmG1在拟南芥叶绿体中的精确亚细胞定位，并分析其与TIC复合体以及转位中前体蛋白的相互作用。
YlmG1蛋白特异性定位于叶绿体被膜
为了阐明YlmG1的亚细胞定位，研究人员克服了YlmG1作为小型疏水蛋白难以制备高效抗体的技术挑战。他们制备了多种针对拟南芥和水稻YlmG1不同肽段（如残基73-232、70-175）及C端合成肽（残基221-232）的抗体，并通过亲和纯化富集了特异性抗体。利用这些抗体对分离的拟南芥完整叶绿体进行亚细胞组分分离和蛋白质免疫印迹分析，结果表明，所有抗体均一致性地检测到一个约13-15 kDa的蛋白质条带，该条带仅存在于被膜组分中，而在类囊体或基质组分中则未出现。使用已知的蛋白标记物（如类囊体蛋白LHCP、基质蛋白cpHsp70、被膜蛋白Tic12）进行验证，确认了组分分离的有效性。这一发现明确推翻了YlmG1位于类囊体膜的先前结论，首次在拟南芥中证明YlmG1是叶绿体被膜特异性定位的蛋白。
YlmG1并非TIC复合体的稳定组成部分
明确了YlmG1的定位后，研究者进一步探究其在被膜中的分子状态及其与TIC复合体的关系。首先，他们利用温和去垢剂毛地黄皂苷溶解叶绿体被膜，通过二维BN-PAGE/SDS-PAGE（蓝绿非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳）结合免疫印迹进行分析。结果显示，TIC核心组分Tic56在约1 MDa大小附近迁移，这与之前报道的TIC复合体大小一致。然而，YlmG1的蛋白条带则出现在BN-PAGE胶的前沿（< 60 kDa），表明其不与TIC复合体共迁移，可能以单体或小分子复合物形式存在。
为了排除BN-PAGE中使用的考马斯亮蓝染料（G-250）可能破坏蛋白复合体天然构象的影响，研究人员进一步进行了尺寸排阻色谱分析。将毛地黄皂苷溶解的被膜蛋白上样至Superose 6柱分离，结果显示Tic56主要位于空体积（Void Volume）附近的组分，与Ycf2/FtsHi马达复合体组分FtsH12的洗脱位置部分重叠，提示可能存在更大的超复合体。而YlmG1则主要在接近柱体积的组分中被洗脱，对应较小的蛋白分子（< 43 kDa）。这进一步确认YlmG1是独立于TIC复合体存在的分子实体。
为了获得更直接的证据，他们进行了免疫共沉淀（Pull-down）实验。利用表达蛋白A（Protein A）标记的Tic20的转基因拟南芥株系，在150 mM或500 mM NaCl存在下，用IgG-琼脂糖珠纯化TIC复合体。结果表明，即使在生理盐浓度下，核心TIC组分Tic56和Tic100也能与标记的Tic20稳定共纯化，而被膜标志蛋白Tic110则不能。YlmG1在任何盐浓度下均未与TIC复合体共纯化，这确凿地证明YlmG1并非TIC复合体的稳定结合组分。
YlmG1在蛋白质转运过程中被招募至转位中间体复合物
既然YlmG1不是TIC的稳定组分，那么它是否在蛋白转运的特定阶段发挥作用？为了探究YlmG1是否与正在转位的前体蛋白相互作用，研究人员进行了体外蛋白质输入实验。他们将分离的完整拟南芥叶绿体与带有转运肽和HA/PA标签的模型前体蛋白pSSC-HAPA一起孵育。随着ATP浓度的增加，输入并加工成熟的蛋白mSSC-HAPA的量也随之增加，验证了其ATP依赖性跨膜转运。
在含有中等浓度ATP（0.5 mM）的条件下进行体外输入后，用毛地黄皂苷溶解叶绿体。当通过BN-PAGE分离时，一部分pSSC-HAPA与Tic56一起出现在约1 MDa或更大的复合物区域。然而，YlmG1蛋白仍主要出现在BN-PAGE胶前沿，这可能是因为体外实验中形成的转位中间体丰度远低于内源被膜蛋白。为了稳定和富集这些瞬时存在的中间体，研究者在BN-PAGE前使用了可裂解的交联剂DSP处理样品。结果显示，pSSC-HAPA在约1 MDa区域的信号显著增强，表明在该条件下成功累积了转位中间体复合物。
接下来，在不进行DSP交联的情况下，研究人员利用抗PA标签的亲和层析，直接从毛地黄皂苷溶解的样品中纯化与pSSC-HAPA结合的蛋白复合物。结果发现，Tic56和Tic100的共纯化程度依赖于输入反应中ATP的浓度，证明了它们与转运中间体的特异性结合。YlmG1同样以ATP依赖的方式被共纯化，而Tic110和非TIC核心组分的Tic40则未检测到。这明确表明，YlmG1在蛋白质跨膜转运过程中，会与其他TIC组分一起被特异性招募至前体蛋白-转位中间体复合物。
这项发现得到了另一项独立的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS） 数据的支持。在之前一项利用不同前体蛋白pFd-TEV-ProteinA进行体外输入的研究中，研究人员通过LC-MS/MS分析了纯化的转位中间体复合物。数据显示，YlmG1仅在含有中等浓度ATP（0.5 mM，利于中间体积累）的输入条件下被检测为中间体相关蛋白之一，尽管其质谱检测到的肽段丰度不高。结合本研究的生化共纯化数据，这些证据共同证实了YlmG1确实参与叶绿体蛋白质输入过程。
讨论与展望：YlmG1可能作为蛋白质转运的“守门人”
综合上述发现，本研究得出结论：在拟南芥中，YlmG1蛋白特异性地定位于叶绿体被膜。虽然它不是TIC的稳定组分，并可能以单体形式存在，但在前体蛋白转运过程中，它会被招募到转位中间体复合物中，与其他TIC核心组分协同作用。鉴于YlmG1已被证明是叶绿体生物发生和植物生存所必需的，该蛋白可能在蛋白质跨叶绿体内被膜的转运过程中扮演着重要且不可或缺的角色。
本研究的结果与近期发表的莱茵衣藻TIC复合物的冷冻电镜（CryoEM）结构高度一致。该结构显示，YlmG的两个跨膜螺旋与Tic20的一个跨膜螺旋（TM3）紧密结合。拟南芥TIC的冷冻电镜结构也显示出由Tic20、Tic12和Tic214的跨膜结构域形成的凹陷腔。而AlphaFold 3预测的拟南芥TIC与YlmG1复合物结构，同样支持YlmG1结合在Tic20的类似位置，预测的置信度（plDDT和PAE分数）较高。值得注意的是，在莱茵衣藻结构中，YlmG结合在Tic20形成的凹陷腔边缘。这个腔被认为是前体蛋白的跨膜通道。本研究发现YlmG1是动态而非稳定地结合TIC，这支持了一个观点：YlmG1可能仅在前体蛋白通过TIC进行转位时才被招募到这个预测的位置。
基于结构和功能类比，研究人员提出了一个有趣的假设。YlmG1是一个双跨膜螺旋蛋白，这让人联想到线粒体蛋白输入系统中的Mgr2蛋白。Mgr2也是一个双跨膜螺旋蛋白，与含有四个跨膜螺旋的Tim17/Tim23复合体（线粒体内膜转位子）相互作用。研究表明，Mgr2在线粒体前体蛋白转位过程中，起到“守门人”的作用，它可以封闭Tim17的侧向开口，以促进转运过程，并/或帮助转运中的蛋白质侧向释放到脂质相中。
类比于此，YlmG1可能作为叶绿体TIC复合体的“侧向守门人”。它结合在由Tic20/Tic12/Tic214形成的凹陷腔附近，其功能可能是调控前体蛋白的命运：是将其完全转运进入基质，还是将其侧向释放到叶绿体内被膜中。这种“守门”功能对于叶绿体蛋白输入可能至关重要，因为许多进入叶绿体的、具有疏水跨膜结构域的类囊体膜蛋白，需要被精确地分选，以防止其被错误地侧向释放到内被膜中。YlmG1在叶绿体生物发生中的绝对必需性，可能就与其在TIC相关的这种“守门”功能有关。
为了验证这些假设，未来需要更深入的生化分析，例如在各种转运前体蛋白与YlmG1及其他TIC组分之间进行广泛的交联实验。这需要一个更强效、更高特异性的YlmG1抗体。此外，解析结合了不同细胞器内定位前体蛋白的TIC复合体的高分辨率冷冻电镜结构，对于阐明蛋白质通过TIC转位的详细分子机制至关重要。这些研究将进一步完善我们对叶绿体蛋白质输入这一基础而关键的生命过程的理解。
