《Sleep Research》：Association of insomnia, insulin resistance traits, and cardiovascular disease risk: A two-step Mendelian randomization study
引言
失眠是最常见的睡眠障碍，以入睡或维持睡眠困难、早晨难以醒来或感觉睡眠无法恢复精力为特征。观察性研究已证实失眠对心脏的负面影响。心血管疾病是全球范围内死亡和残疾的主要原因，约占总死亡人数的三分之一，并给社会带来巨大的经济负担。过去十年的累积证据表明，失眠是心血管疾病的一个重要危险因素。尽管先前的孟德尔随机化研究提示失眠可能是包括心力衰竭、缺血性中风和心肌梗死在内的多种心血管疾病的因果风险因素，但失眠与心血管疾病之间因果关联的潜在通路尚未得到充分研究。先前研究表明，失眠与代谢紊乱相关，如胰岛素抵抗、血脂异常和2型糖尿病。理解这些危险因素是否在从失眠到心血管疾病的因果通路中充当潜在中介，将为降低心血管疾病风险提供新的干预靶点。
孟德尔随机化是一种流行病学方法，通过利用遗传变异作为暴露的无混杂代理变量来估计其对感兴趣结局的影响，从而加强因果推断。概念上，孟德尔随机化类似于随机对照试验，其中遗传变异在个体受孕时随机分配，独立于出生后的环境和社会经济混杂因素。因此，它可以克服观察性研究中残留混杂效应和反向因果关系的局限性。孟德尔随机化方法的最新进展包括两步法和多变量孟德尔随机化，可用于研究中介效应。先前的孟德尔随机化研究强烈支持失眠对多种心血管疾病的潜在因果效应，并有证据表明其通过体重指数、甘油三酯和高密度脂蛋白胆固醇等危险因素发挥中介作用。然而，这些研究并未评估胰岛素抵抗和2型糖尿病在失眠与心血管疾病关联中的潜在中介作用。
考虑到失眠与血糖特征的密切关联，先前研究表明基因预测的失眠与胰岛素抵抗和2型糖尿病等代谢紊乱相关，而基因预测的胰岛素抵抗和2型糖尿病与心室结构的不利变化以及更高的心力衰竭风险相关，这表明胰岛素抵抗和2型糖尿病都可能中介失眠与心血管疾病之间的因果关联。此外，胰岛素抵抗和2型糖尿病都是可改变的危险因素，可以使用现有的药物（如二甲双胍和吡格列酮）进行有效治疗。
在本研究中，我们利用已发表的基因组关联研究的汇总数据，进行了两步法孟德尔随机化分析，以评估和量化胰岛素抵抗及其相关特征（即空腹血糖、空腹胰岛素、糖化血红蛋白、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇和2型糖尿病）在失眠与五种心血管疾病（即心力衰竭、冠状动脉疾病、高血压、心房颤动和心肌梗死）关联中的中介作用。在敏感性分析中，也使用了多变量孟德尔随机化来进一步检验胰岛素抵抗及其特征在失眠到心血管疾病因果通路中的中介作用。
方法
孟德尔随机化研究设计
本研究的分析策略如图1所示。首先，我们试图确认失眠与五种心血管疾病风险之间的因果关联。其次，我们基于两步法孟德尔随机化方法评估了胰岛素抵抗及其特征在失眠与心血管疾病因果通路中的中介效应。第一步，我们使用两样本孟德尔随机化方法分析失眠与胰岛素抵抗相关特征之间的关联。第二步，我们探讨了胰岛素抵抗相关特征与五种心血管疾病风险之间的关联。最后，通过“系数乘积法”估计了胰岛素抵抗及其特征在失眠到心血管疾病因果通路中所占的比例。本研究报告遵循“使用孟德尔随机化加强流行病学观察性研究报告指南”。
数据来源
孟德尔随机化研究的假设
在孟德尔随机化研究中，感兴趣的遗传工具变量需要满足以下假设：1. 工具变量与感兴趣的暴露密切相关（相关性假设）；2. 暴露-结局关系不存在混杂（独立性假设）；3. 工具变量仅通过暴露影响结局（排他性限制）。
失眠的遗传变异
本研究中失眠的定义与先前研究一致。我们使用了最近发表且可用的汇总数据，该数据报告了欧洲血统个体中与失眠相关的遗传变异。失眠的诊断基于自我报告评估。我们从最大的基因组关联研究中选择了248个在基因组水平上显著相关的独立单核苷酸多态性，该研究包括1,331,010名个体，解释了2.6%的方差。在主分析中，经过连锁不平衡的聚类程序后，共鉴定出158个独立的单核苷酸多态性作为工具变量。为了最大程度地减少可能违反孟德尔随机化独立性假设的情况，我们在PhenoScanner数据库中搜索了这158个独立单核苷酸多态性与潜在混杂因素在基因组水平上的关联，并在敏感性分析中进一步排除了33个与心血管疾病潜在混杂因素相关的单核苷酸多态性。
潜在中介的遗传变异
在本研究中，我们纳入了胰岛素抵抗及其相关特征，包括空腹胰岛素、空腹血糖、糖化血红蛋白、2型糖尿病、高密度脂蛋白胆固醇和甘油三酯作为潜在中介。空腹胰岛素、空腹血糖和糖化血红蛋白的遗传变异来自“葡萄糖和胰岛素相关特征荟萃分析联盟”。高密度脂蛋白胆固醇和甘油三酯的遗传变异来自“全球脂质遗传学联盟”，该联盟包括1,320,016名欧洲参与者。2型糖尿病的遗传变异来自一项孟德尔随机化研究的汇总数据，该研究包括62,892名病例和596,424名欧洲血统对照参与者。胰岛素抵抗的遗传变异是一个复合表型，来自Lotta等人的研究。由于胰岛素抵抗是一个复合表型，我们也纳入了高密度脂蛋白胆固醇和甘油三酯作为本研究中的潜在中介。我们在孟德尔随机化分析中选择了47个胰岛素抵抗相关的单核苷酸多态性、33个空腹血糖相关的、10个糖化血红蛋白相关的、211个甘油三酯相关的、188个高密度脂蛋白胆固醇相关的、5个校正了体重指数的空腹胰岛素相关的以及113个2型糖尿病相关的单核苷酸多态性作为工具变量。
心血管疾病结局的数据来源
心力衰竭的汇总数据来自大规模孟德尔随机化研究的荟萃分析，包括47,309名病例和930,014名对照。冠状动脉疾病的汇总数据来自最新的孟德尔随机化荟萃分析，包括122,733名病例和424,528名对照。高血压的汇总数据来自FinnGen研究，包括85,491名病例和156,457名对照。心房颤动的汇总数据来自Nielsen等人进行的最大的孟德尔随机化荟萃分析。我们从英国生物银行的fastGWA-GLMM分析中获得了心肌梗死的汇总数据。关于失眠、潜在中介和结局的数据来源的更多细节如表1所示。所有孟德尔随机化研究均由相关的机构审查委员会伦理批准，原始孟德尔随机化研究中的参与者均签署了知情同意书。由于数据来自公开的汇总数据，因此本研究不需要伦理批准。
统计分析
主要孟德尔随机化分析
我们使用基于两样本孟德尔随机化分析的逆方差加权法估计了失眠对五种心血管疾病的总效应。当水平多效性平衡或没有水平多效性时，逆方差加权法可以提供无偏估计。当Cochran's Q检验结果显示工具变量间存在显著异质性时，在主孟德尔随机化分析中使用逆方差加权法的随机效应模型。结果以比值比及其95%置信区间表示。经过Bonferroni校正后，p值小于0.01被认为是因果关联显著。
孟德尔随机化中介分析
我们进行了两步两样本孟德尔随机化分析，以评估胰岛素抵抗及其相关特征是否在失眠到五种心血管疾病的因果通路中具有中介效应。第一步是估计失眠与胰岛素抵抗相关特征之间的效应。结果以β系数或比值比及其相应的95%置信区间表示。效应大小表示为胰岛素抵抗（校正体重指数的空腹胰岛素增加55%、甘油三酯增加0.89 mmol/L和高密度脂蛋白胆固醇降低0.46 mmol/L）、空腹胰岛素增加0.60 ln[pmol/L]、空腹血糖增加0.65 mmol/L、甘油三酯增加90.72 mg/dL、高密度脂蛋白胆固醇增加15.51 mg/dL以及糖化血红蛋白水平每增加1%所引起的结局变化。为了解释我们分析中的多重检验，我们使用了Bonferroni校正的显著性水平p值小于0.007。p值在0.007到0.05之间被认为是潜在因果关联的提示性证据。第二步是估计胰岛素抵抗及其特征对五种心血管疾病的效应。此外，我们使用“系数乘积法”获得了中介效应。字母“A”代表失眠与胰岛素抵抗及其相关特征相关的效应估计，字母“B”代表胰岛素抵抗特征与五种心血管疾病相关的效应估计。每个中介的间接效应是通过“A”乘以“B”得到的。直接效应是通过从失眠对心血管疾病的总效应中减去胰岛素抵抗特征的间接效应得到的。由每个中介介导的失眠对五种心血管疾病结局总效应的比例是通过将间接效应除以总效应来估计的。使用delta法估计比例中介的置信区间。
孟德尔随机化敏感性分析
我们进行了几项敏感性分析以评估孟德尔随机化结果的稳健性，包括加权中位数、孟德尔随机化-Egger回归方法、孟德尔随机化多效性残差和与离群值以及多变量孟德尔随机化。加权中位数规定分析中至少50%的权重来自作为有效工具变量的遗传变异。孟德尔随机化-Egger方法可以检测和校正遗传变异的潜在定向多效性。我们使用修正的Cochran's Q统计量评估了个体遗传变异的异质性。为了避免主要由单个单核苷酸多态性驱动的因果估计，我们进行了留一分析。孟德尔随机化多效性残差和与离群值可以识别和去除潜在多效性单核苷酸多态性的离群值。此外，我们使用散点图展示单核苷酸多态性-暴露和单核苷酸多态性-结局之间的关联。如果存在潜在的回文单核苷酸多态性，则在排除回文单核苷酸多态性后重复孟德尔随机化分析。之后，为了检验工具变量的有效性，使用了F统计量，F小于10表明可能存在弱工具变量。进行了双向孟德尔随机化分析以评估失眠与中介之间潜在的双向因果关联。在敏感性分析中也进行了多变量孟德尔随机化，以进一步检验胰岛素抵抗及其特征在失眠到心血管疾病因果通路中的中介效应。所有分析均在R 4.1.3版本中使用“孟德尔随机化”、“两样本孟德尔随机化”和“孟德尔随机化多效性残差和与离群值”包进行。
结果
基因预测的失眠与五种心血管疾病风险呈正相关
在孟德尔随机化分析中，有强有力的证据表明基因预测的失眠与所有五种心血管疾病风险呈正相关。我们发现基因预测的失眠与更高的心力衰竭风险、高血压风险、心肌梗死风险、冠状动脉疾病风险和心房颤动风险相关。在主逆方差加权孟德尔随机化分析中，基因预测的失眠与心力衰竭、高血压、心肌梗死、冠状动脉疾病和心房颤动的风险增加显著相关。
此外，在主孟德尔随机化分析和敏感性孟德尔随机化分析中，基因预测的失眠与每种心血管疾病之间的关联方向一致。孟德尔随机化-Egger回归检验未显示多效性证据。在排除潜在的多效性单核苷酸多态性后，对剩余单核苷酸多态性的分析并未显著改变主要结果。失眠对所有五种心血管疾病的散点图直观地显示所有孟德尔随机化估计方向一致。留一分析表明，在排除任何单个单核苷酸多态性后，关联仍然稳健。
基因预测的失眠与胰岛素抵抗及其相关特征显著相关
有强有力的证据表明基因预测的失眠与较高的2型糖尿病风险、较高的胰岛素抵抗水平、较高的空腹胰岛素水平、较高的空腹血糖水平、较高的甘油三酯水平和较低的高密度脂蛋白胆固醇水平相关。此外，有提示性证据表明基因预测的失眠与较高的糖化血红蛋白水平相关。
失眠与这些潜在中介之间的关联方向在各种孟德尔随机化敏感性分析中基本一致。孟德尔随机化多效性残差和与离群值未发现失眠与胰岛素抵抗、空腹血糖、空腹胰岛素和糖化血红蛋白之间存在任何显著的离群单核苷酸多态性。在孟德尔随机化-Egger截距检验中未显示存在水平多效性的迹象，并且除空腹胰岛素、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇和2型糖尿病外未发现异质性证据。在排除回文单核苷酸多态性后，基因预测的失眠也与胰岛素抵抗及其相关特征显著相关。此外，散点图和留一分析进一步证实了主要结果的稳健性。没有证据表明失眠与潜在中介之间存在反向因果关系。
基因预测的胰岛素抵抗及其相关特征与除心房颤动外的四种心血管疾病风险显著相关
我们进一步研究了胰岛素抵抗及其相关特征与心血管疾病风险之间的关联。图4显示，基因预测的胰岛素抵抗每标准差增加与心力衰竭、高血压、心肌梗死和冠状动脉疾病的风险呈正相关。此外，正如预期的那样，基因预测的2型糖尿病与心力衰竭、高血压、心肌梗死和冠状动脉疾病的风险呈正相关。
此外，基因预测的甘油三酯每标准差增加与心力衰竭、高血压、心肌梗死和冠状动脉疾病的风险呈正相关，而基因预测的高密度脂蛋白胆固醇每标准差增加与心力衰竭、高血压、心肌梗死和冠状动脉疾病的风险呈负相关。有趣的是，没有证据支持基因预测的胰岛素抵抗及其相关特征对心房颤动风险有潜在的因果效应。
在敏感性分析中，其他孟德尔随机化方法的估计结果与主要结果一致。胰岛素抵抗及其特征对所有心血管疾病的散点图显示一致方向。在孟德尔随机化-Egger回归检验中没有潜在多效性存在的证据。留一分析表明，在排除任何单个单核苷酸多态性后，关联仍然稳健。
胰岛素抵抗及其相关特征在失眠与四种心血管疾病风险关联中的中介效应
我们计算了胰岛素抵抗及其相关特征在失眠到心血管疾病风险因果通路中的中介效应比例。结果显示，基因预测的胰岛素抵抗、高密度脂蛋白胆固醇、2型糖尿病和甘油三酯对四种心血管疾病有不同的中介效应，中介比例在不同特征和心血管疾病中介于3.0%到50.7%之间。图5直观地表明，胰岛素抵抗、高密度脂蛋白胆固醇、甘油三酯和2型糖尿病在失眠与心血管疾病的关联中具有显著的中介效应。特别是，胰岛素抵抗和2型糖尿病在失眠与心力衰竭、心肌梗死、高血压和冠状动脉疾病的关联中具有最高的中介效应比例。多变量孟德尔随机化分析进一步提供了支持胰岛素抵抗及其相关特征在失眠与心血管疾病因果通路中潜在中介效应的证据。
讨论
在这项两步两样本孟德尔随机化研究中，我们发现基因预测的失眠症状在多重检验校正后与五种心血管疾病风险和六种胰岛素抵抗相关特征显著相关，而基因预测的胰岛素抵抗及其相关特征与四种心血管疾病风险相关。中介分析提供了强有力的证据，证明胰岛素抵抗、2型糖尿病、甘油三酯和高密度脂蛋白胆固醇在失眠到除心房颤动外的四种心血管疾病的因果通路中具有中介效应，中介效应比例在不同特征和心血管疾病中介于4.5%到50.7%之间。在这些潜在中介中，最主要的两个贡献者是胰岛素抵抗和2型糖尿病。我们的结果表明，基因预测的失眠症状与更高的心血管疾病风险相关，胰岛素抵抗及其相关特征可能中介了潜在的关联。因此，对这些可改变风险因素的干预可能具有显著降低因失眠导致的心血管疾病负担的潜力。尽管本研究使用了大规模已发表的孟德尔随机化数据，但失眠的定义未来应进一步完善和澄清。
先前的流行病学研究已表明失眠与心血管疾病之间的关联。我们当前的工作表明失眠是心血管疾病的一个潜在因果风险因素，该结果与其他孟德尔随机化研究一致。基于我们的两步法孟德尔随机化分析，基因预测的失眠与胰岛素抵抗及其相关特征（包括空腹胰岛素、空腹血糖、2型糖尿病、糖化血红蛋白、甘油三酯和高密度脂蛋白胆固醇）存在因果关联。然而，最近的一项网络孟德尔随机化研究表明，基因预测的失眠与2型糖尿病存在因果关联，但与空腹血糖、空腹胰岛素或糖化血红蛋白无关。这种差异可能源于原始孟德尔随机化研究的数据来源和样本量的不同。总之，这些发现表明失眠可能是胰岛素抵抗及其相关特征的一个因果风险因素。
血糖异常和血脂异常都是观察性研究中公认的心血管疾病危险因素。我们的发现进一步提供了支持胰岛素抵抗及其相关特征对心血管疾病风险具有潜在因果效应的证据。先前的孟德尔随机化研究表明，2型糖尿病、胰岛素抵抗、糖化血红蛋白和甘油三酯与心力衰竭、心肌梗死和冠状动脉疾病等心血管疾病的风险存在因果关联。此外，最近的一项孟德尔随机化研究表明，基因预测的甘油三酯与高血压高风险相关，而基因预测的高密度脂蛋白胆固醇与高血压低风险相关。然而，我们没有发现胰岛素抵抗及其相关特征与心房颤动风险之间存在任何显著关联；其他孟德尔随机化研究也报告了类似的发现。失眠导致心房颤动的主要机制可能独立于本研究感兴趣的中介通路。失眠可能通过其他更直接、非代谢的途径引发心房颤动。例如，失眠可加剧自主神经系统失衡，表现为迷走神经张力降低和交感神经系统活性增加，这会直接干扰心房电活动的稳定性。心脏电生理学研究表明，这种失衡可延长心房复极时间并增加心房颤动的触发频率。最近的一项孟德尔随机化研究表明，甘油三酯和高密度脂蛋白胆固醇可能在失眠与冠状动脉疾病和高血压等几种心血管疾病的因果关联中发挥中介作用。我们的研究进一步强调，胰岛素抵抗和2型糖尿病可能是失眠与心血管疾病关联中的重要中介。值得注意的是，我们的数据显示，失眠与心血管疾病之间4.5%到50.7%的关联是由这些潜在中介介导的，这强烈表明，管理这些中介可能是降低失眠患者心血管疾病风险的关键目标。
胰岛素抵抗及其相关特征在失眠与心血管疾病关联中起中介作用的潜在机制尚不清楚。一种可能的解释是失眠诱导的下丘脑-垂体轴失调和交感神经系统激活，这导致促肾上腺皮质激素和皮质醇分泌增加，进而导致胰岛素抵抗和血脂异常，最终增加心血管疾病的风险。临床前研究表明，全身性炎症与β细胞功能障碍有关，而炎症已被确定为胰岛素抵抗和2型糖尿病的潜在中介。免疫炎症失衡是失眠增加心血管疾病风险的潜在机制之一，因此慢性炎症可能是胰岛素抵抗和2型糖尿病中介失眠增加心血管疾病风险的途径。最近的研究表明，肠道菌群紊乱会增加2型糖尿病和心血管疾病的风险，而失眠可以改变肠道菌群。肠道菌群失衡是胰岛素抵抗和2型糖尿病中介失眠并增加心血管疾病风险的另一个潜在机制。
这项研究为失眠、胰岛素抵抗相关特征与心血管疾病风险之间的潜在因果关联提供了新的证据。重要的是，结果强烈表明胰岛素抵抗及其相关特征可能在失眠与心血管疾病的因果关联中发挥中介作用。这些发现也暗示了未来药物治疗和实践干预的潜在目标，例如改善胰岛素抵抗、管理甘油三酯或高密度脂蛋白胆固醇以及治疗2型糖尿病。通过优先制定针对失眠患者胰岛素抵抗及其相关特征的有效预防和治疗策略，公共卫生工作可以减少与心血管疾病相关的显著发病率和死亡率。这一策略将失眠管理扩展到代谢健康，将重点从“治疗疾病”转向“预防风险”。此外，我们的发现可以提高人们对改善失眠在预防心血管疾病中重要性的认识。
本研究存在几个局限性。首先，由多效性引起的潜在偏倚不能完全排除。然而，我们的孟德尔随机化敏感性分析的结果与我们的主要结果一致，降低了多效性偏倚的可能性。其次，由于缺乏大规模队列中的可用数据，本研究中胰岛素抵抗的测量并非金标准。然而，胰岛素抵抗的遗传风险评分与Fenland研究和另外四个队列的金标准测量相关。第三，失眠的评估源自自我报告的问卷；因此，本研究中可能存在主观偏倚。第四，我们的分析仅限于欧洲血统的个体，这使得我们的研究结果难以推广到其他种族群体。第五，2型糖尿病是一个二元性状，由于比值比的不可折叠性，可能导致中介分析中的估计偏倚；使用系数乘积法可以减少这种偏倚。最后，本研究纳入了多种胰岛素抵抗及其特征，增加了多重比较的负担，这可能会降低分析的效力并增加I类错误。
结论
总之，我们的研究结果表明，基因预测的失眠与更高的心血管疾病风险相关，其中相当大的部分是由胰岛素抵抗及其相关特征（如2型糖尿病和高甘油三酯）介导的。针对这些因素的干预可能具有显著降低因睡眠质量差导致的心血管疾病负担的潜力。
