PTEN缺失通过诱导PI3Kβ酪氨酸磷酸化（Y962位点）及与EPHA2/SRC形成复合物驱动肿瘤发生：一个可成药的机制与生物标志物

《Cancer Discovery》：PTEN Loss Promotes PI3Kβ Phosphorylation and EPHA2/SRC/p-PI3KβY962 Complex Assembly to Drive Tumorigenesis Open Access

本研究发现了一个针对PTEN缺失肿瘤的、超越传统PI3K激酶抑制的新药靶点。研究者揭示了PTEN作为酪氨酸磷酸酶，其功能缺失会上调PI3Kβ在Y962位点的磷酸化(p-PI3KβY962)，促进与EPHA2/SRC形成三重复合体，激活致癌性pERK/c-MYC和pAKT通路。该工作不仅阐述了关键机制，还开发了特异性抗体，证实p-PI3KβY962是有效的生物标志物，并发现已获FDA批准的SRC/EPHA2抑制剂Dasatinib在PTEN缺失肿瘤模型中展现出显著疗效，为未来靶向治疗开发和临床试验重新利用Dasatinib提供了方向。

　　

BioID蛋白相互作用分析揭示了PTEN缺失诱导癌细胞中PI3Kβ–EPHA2相互作用

为了探究PTEN缺失背景下PI3Kα和/或PI3Kβ是否形成新的相互作用，研究者在PTEN缺失的乳腺癌细胞系中进行了针对两种亚型的BioID邻近标记分析。有趣的是，PI3Kα和PI3Kβ在这些PTEN缺失的三阴性乳腺癌细胞中显示出不同的相互作用组，两种亚型之间只有大约30%的重叠。在BT549和MDA-MB-468细胞中均与PI3Kβ选择性相关的四个相互作用蛋白中，EPHA2是丰度最高且唯一在质膜上与PI3Kβ共定位的蛋白。共免疫沉淀分析进一步验证了在PTEN缺失的BT549和HCC70细胞中，内源性EPHA2与PI3Kβ相互作用，而不与PI3Kα相互作用。在PTEN野生型HEK293T细胞中，EPHA2与两种亚型的相互作用相当。然而，PTEN敲除显著增加了EPHA2–PI3Kβ的相互作用，同时减少了EPHA2–PI3Kα的相互作用。相反，在PTEN缺失的BT549细胞中恢复PTEN表达，显著削弱了外源性和内源性EPHA2与PI3Kβ的相互作用。这些结果表明，PTEN缺失特异性地促进了EPHA2和PI3Kβ之间更强的相互作用。

PTEN作为蛋白质酪氨酸磷酸酶通过去磷酸化PI3Kβ的酪氨酸-962位点调控PI3Kβ–EPHA2相互作用

研究者接下来探究了PTEN缺失增强PI3Kβ–EPHA2相互作用的机制。除了其众所周知的将PIP3转化为PIP2的脂质磷酸酶活性外，PTEN还具有蛋白质酪氨酸磷酸酶活性。研究者发现，与PTEN野生型细胞相比，PTEN敲除细胞中免疫沉淀的PI3Kβ的磷酸化酪氨酸水平显著升高，而PI3Kα则没有。在稳定表达PTEN野生型或不同功能缺失突变体的PTEN缺失细胞系中，重新表达PTEN野生型或脂质磷酸酶活性缺陷的G129E突变体显著降低了PI3Kβ上的p-Tyr水平，而蛋白质磷酸酶活性缺陷的Y138L或双重缺陷的C124S突变体几乎没有影响。这些结果表明PTEN通过其蛋白质磷酸酶活性调节PI3Kβ的酪氨酸磷酸化。此外，共沉淀显示PTEN与PI3Kβ相互作用，并且底物捕获突变体PTEN-C124S在两种细胞中都比PTEN野生型显示出与PI3Kβ更强的结合。这些发现支持PI3Kβ是PTEN的真正的生理底物。一致地，在PTEN缺失的BT549细胞中表达PTEN野生型或PTEN-G129E显著降低了PI3Kβ–EPHA2相互作用，而PTEN-Y138L或PTEN-C124S则没有。这些结果表明PTEN作为一种蛋白质磷酸酶，调节PI3Kβ磷酸化及其与EPHA2的相互作用。

为了鉴定PI3Kβ上哪个磷酸化位点受PTEN调控，研究者从PTEN敲除的HEK293T细胞中表达并纯化了Flag标记的PI3Kβ，用于LC-MS/MS分析。该分析检测到PI3Kβ在酪氨酸962位点和苏氨酸930位点的磷酸化，这两个位点在物种间高度保守。在无细胞去磷酸化实验中，PTEN野生型和PTEN-G129E突变体能有效去磷酸化含有磷酸化Y962的合成PI3Kβ肽段。相反，蛋白质磷酸酶缺陷的突变体PTEN-Y138L和PTEN-C124S则不能。值得注意的是，所有PTEN变体均不能去磷酸化含有pT930的肽段，这表明PTEN作为一种酪氨酸磷酸酶靶向PI3Kβ的Y962位点。

为了研究PI3Kβ在这些位点的磷酸化是否影响PI3Kβ–EPHA2相互作用，研究者构建了模拟非磷酸化或磷酸化状态的PI3Kβ突变体。在沉默内源性PI3Kβ的BT549细胞中，与PI3Kβ野生型相比，Y962F和T930A/Y962F突变体显著削弱了与EPHA2的相互作用，而单独的T930A突变在PTEN缺失的BT549细胞或PTEN敲除的HEK293T细胞中没有影响。这些结果表明，PI3Kβ-Y962的去磷酸化削弱了PTEN缺失细胞中PI3Kβ–EPHA2的相互作用。相反，在PTEN野生型的MDA-MB-231细胞中，表达磷酸模拟突变体T930E或T930E/Y962E增强了PI3Kβ–EPHA2的相互作用，而单独的T930E突变没有显著影响。对Flag标记的PI3Kβ和EPHA2的免疫荧光染色显示，磷酸模拟突变体PI3Kβ-Y962E主要定位于质膜并与EPHA2共定位，而非磷酸化的PI3Kβ-Y962F突变体则主要在细胞质中。野生型PI3Kβ表现出介于Y962E和Y962F之间的中间膜定位。这些结果支持PI3Kβ-Y962磷酸化增加了其与EPHA2的相互作用，促进了PTEN缺失细胞中PI3Kβ的膜定位。总之，这些结果表明PTEN通过调节PI3Kβ在Y962位点的磷酸化来控制PI3Kβ–EPHA2相互作用，而PTEN的缺失通过允许持续的PI3Kβ-Y962磷酸化来促进这种相互作用。

持续的PI3Kβ磷酸化支持PTEN缺失肿瘤的生长

为了评估PTEN缺失诱导的PI3Kβ酪氨酸磷酸化在肿瘤发生中的功能重要性，研究者检验了磷酸化缺陷的PI3Kβ突变体是否能够模拟PI3Kβ基因敲除的表型并抑制PTEN缺失肿瘤的生长。研究者使用了源自同时缺失Pten和Trp53并敲除Pik3cb的乳腺癌基因工程小鼠模型的原发性PPB肿瘤细胞。PPB细胞易于在体外生长，但在体内缺乏形成肿瘤的能力，这为评估各种PI3Kβ突变体的致癌功能提供了一个可操作的等基因平台。研究者用小鼠PI3Kβ野生型或磷酸化缺陷的PI3Kβ变体重构了PPB细胞。与在人类PTEN缺失癌细胞中的观察结果一致，添加回Y956F突变体或T924A/Y956F双突变体减少了PI3Kβ与EPHA2的结合，而单独的T924A突变没有明显影响。这些结果表明，小鼠PI3Kβ-Y956的去磷酸化损害了小鼠PTEN缺失肿瘤中PI3Kβ–EPHA2的相互作用。

为了评估这种相互作用在体内的功能后果，研究者将这些工程化的PPB肿瘤细胞原位移植到FVB小鼠的乳腺脂肪垫中。虽然PI3Kβ野生型恢复了PPB细胞的致瘤潜能，但Y956F和T924A/Y956F突变体恢复肿瘤生长的能力显著减弱，并伴有Ki67染色减少，表明增殖受损。这些结果表明PI3Kβ的磷酸化对于PTEN缺失的乳腺肿瘤生长至关重要。研究者将这一分析扩展到PTEN缺失的前列腺癌模型PC3细胞。在耗竭内源性PI3Kβ后，研究者过表达了野生型或非磷酸化的人PI3Kβ突变体，并将这些工程化的PC3细胞移植到Balb/c裸鼠中。虽然PI3Kβ野生型促进了强劲的肿瘤生长，但Y962F和T930A/Y962F突变体大大降低了这种效应。一致地，表达Y962F或T930A/Y962F双突变体的肿瘤显示Ki67水平显著降低。总之，这些数据表明，PI3Kβ的酪氨酸磷酸化对于驱动多种PTEN缺失癌症模型的体内肿瘤发生至关重要。

PI3Kβ-Y962磷酸化升高与乳腺癌和前列腺癌患者的PTEN缺失密切相关

为了进一步评估PTEN介导的PI3Kβ^Y962磷酸化，研究者开发了一种特异性识别人PI3Kβ在Y962位点磷酸化的多克隆抗体，该抗体也与相应的小鼠位点有交叉反应。通过蛋白质印迹和免疫荧光测定验证证实，该抗体可选择性检测多种细胞系中过表达和内源性的p-PI3Kβ^Y962。

研究者接下来评估了PTEN表达与p-PI3Kβ^Y962水平之间的关系。免疫荧光分析显示，在BT549/PI3Kβ野生型和PC3/PI3Kβ野生型细胞中均有强烈的p-PI3Kβ^Y962染色，而在它们各自的Y962F对应细胞中信号缺失。蛋白质印迹证实，PI3Kβ敲低降低了p-PI3Kβ^Y962水平，重新表达PI3Kβ野生型可以恢复，但Y962F突变体不能。此外，在BT549细胞中外源性表达PTEN显著降低了内源性p-PI3Kβ^Y962水平，而在PTEN野生型的MDA-MB-157细胞中进行CRISPR介导的PTEN敲除则导致p-PI3Kβ^Y962信号显著增加。总之，这些数据表明p-PI3Kβ^Y962受PTEN紧密控制。

使用这种经过验证的特异性抗p-PI3Kβ^Y962抗体，研究者在两个独立的癌症患者队列中分析了PTEN缺失与p-PI3Kβ^Y962水平之间的关系。首先，研究者对10例携带PTEN突变和10例PTEN野生型对照的匹配三阴性乳腺癌病例进行了多重免疫组化分析。引人注目的是，与PTEN野生型对照相比，PTEN突变肿瘤患者的p-PI3Kβ^Y962水平显著更高。线性回归分析进一步揭示了在该三阴性乳腺癌队列中，PTEN表达与p-PI3Kβ^Y962水平呈强负相关。此外，在PTEN缺失的肿瘤组织内，肿瘤巢旁PTEN完整的基质细胞显示的p-PI3Kβ^Y962水平明显低于PTEN突变的肿瘤细胞，这加强了临床样本中PTEN缺失与p-PI3Kβ^Y962升高之间的联系。

为了扩展这些发现，研究者分析了106名临床特征可比的更大前列腺癌患者队列。与三阴性乳腺癌数据一致，携带PTEN突变的前列腺肿瘤显示出比PTEN野生型肿瘤显著更高的p-PI3Kβ^Y962水平，并且p-PI3Kβ^Y962水平在整个队列中与PTEN水平呈负相关。基于病理学的格里森评分用于分层肿瘤侵袭性。PTEN水平在格里森评分较高的患者中显著降低，而p-PI3Kβ^Y962水平在这些相同的高级别肿瘤中显著升高。

总之，这些数据表明，p-PI3Kβ^Y962水平与PTEN缺失显著相关，并且与三阴性乳腺癌和前列腺癌的不良临床预后相关，突出了其作为预后生物标志物的潜力。这些结果表明，评估p-PI3Kβ^Y962水平可能有助于识别PTEN缺失肿瘤的高危患者，并可能为未来靶向该信号轴的治疗策略提供信息。

PI3Kβ磷酸化促进EPHA2结合以激活PTEN缺失肿瘤细胞中的pERK/c-MYC和AKT信号

研究者接下来研究了PI3Kβ-Y962磷酸化如何通过其与EPHA2的相互作用影响PTEN缺失肿瘤细胞中的下游信号传导。鉴于EPHA2作为一种受体酪氨酸激酶，可以通过与AKT通路的相互反馈环进行调节，并在多种癌症中促进PI3K/AKT和pERK/c-MYC信号传导，研究者假设PTEN缺失使PI3Kβ-Y962磷酸化能够增强EPHA2结合并激活致癌通路。

支持这一假设的是，PI3Kβ耗竭选择性地降低了PTEN缺失乳腺癌模型中的pERK和c-MYC水平。研究者的发现表明，PTEN缺失的肿瘤依赖PI3Kβ来维持pERK/c-MYC信号传导，该通路对实体瘤进展至关重要。为了评估PTEN的磷酸酶活性在调节该通路中的作用，研究者将PTEN野生型和突变体重新引入PTEN缺失的BT549细胞。PTEN野生型和脂质磷酸酶缺陷的G129E显著降低了pERK和c-MYC水平，而蛋白质磷酸酶缺陷的Y138L和双重磷酸酶缺陷的C124S则不能。这些结果表明，PTEN的蛋白质磷酸酶活性，而非其脂质磷酸酶功能，对于抑制PTEN缺失癌症中的ERK/c-MYC通路至关重要。

研究者接下来研究了PI3Kβ磷酸化在调节PTEN缺失肿瘤细胞中pERK/c-MYC信号传导中的作用。在PI3Kβ敲低的BT549细胞中，重新表达PI3Kβ野生型、T930A突变体或激酶失活的K805R突变体恢复了pERK和c-MYC的表达，而Y962F和T930A/Y962F突变体未能挽救这种信号传导。在用野生型或突变体PI3Kβ重构的PPB细胞中也看到了类似的结果。在PTEN阳性的MDA-MB-231细胞中，过表达磷酸模拟突变体PI3Kβ-Y962E和T930E/Y962E与PI3Kβ野生型或单独的T930E相比，显著增加了pERK和c-MYC水平，强调了PI3Kβ-Y962磷酸化对ERK/c-MYC激活的特异性贡献。

为了确定PI3Kβ–EPHA2相互作用是否有助于该通路，研究者破坏了PTEN缺失BT549细胞中的EPHA2功能。EPHA2的基因缺失和药理抑制都显著降低了pERK和c-MYC蛋白水平，支持了PI3Kβ–EPHA2信号在驱动pERK/c-MYC激活中的作用。此外，在PI3Kβ耗竭的BT549细胞中，重新引入PI3Kβ野生型恢复了EPHA2活性，而Y962F和T930A/Y962F突变体则没有。

为了进一步阐明ERK–c-MYC轴作为p-PI3Kβ^Y962–EPHA2信号在PTEN缺失细胞中的下游效应器的作用，研究者检验了其对内源性PI3Kβ敲低的BT549细胞的影响。重新表达PI3Kβ导致p-ERK1/2、p-cMYC^S62和总c-MYC蛋白水平增加。值得注意的是，通过shRNA沉默ERK或药理性抑制ERK显著抑制了c-MYC蛋白水平，特别是p-cMYC^S62，而不影响c-MYC的mRNA表达，这表明ERK通过促进c-MYC的稳定化而非转录，在c-MYC上游发挥作用。此外，阻断ERK或c-MYC活性损害了在缺乏内源性PI3Kβ的BT549细胞中PI3Kβ过表达诱导的增殖效应。这些发现表明，PI3Kβ-Y962磷酸化增强了EPHA2介导的ERK激活，从而稳定了c-MYC并驱动PTEN缺失肿瘤细胞的增殖。

由于在BT549-shPIK3CB细胞中重新表达PI3Kβ Y962F或T930A/Y962F突变体导致p-AKT水平降低，与激酶失活突变体PI3Kβ K8