《Cancer Immunology Research》：T-cell Priming by High-Avidity Neoantigens in Lymph Nodes Augments Adoptive Immunotherapy
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本文通过构建B16F10野生型与B16KVP新抗原高亲和力黑色素瘤模型，系统比较了相同pmel-1 CD8+T细胞产品在不同抗原亲和力背景下的活化、分化与抗肿瘤效能。研究发现，高亲和力新抗原足以激活初始T细胞，诱导其向效应表型分化，并在淋巴结内高效启动，最终介导持久的肿瘤消退与免疫记忆。该工作揭示了肿瘤抗原亲和力差异如何决定T细胞命运，并首次阐明淋巴结早期归巢与溢出是过继性T细胞疗法（ACT）发挥疗效的关键环节，为优化临床ACT产品设计与联合策略提供了重要理论依据。
文章内容归纳总结
T细胞在淋巴结中被高亲和力新抗原启动并增强过继免疫疗法效果
摘要
过继性转移针对新抗原的T淋巴细胞能在实体瘤患者中激发免疫力，但这些抗原如何影响T细胞功能、效应分化和持久性尚不清楚。本研究通过比较表达低亲和力自身/肿瘤相关抗原或高亲和力新抗原的黑色素瘤对同一CD8+T细胞产物的塑造作用，并动态分析这两种背景下T细胞在宿主组织中的分化谱。研究发现，高亲和力新抗原的表达足以激活初始CD8+T细胞，从而在肿瘤再次攻击时引发强劲的肿瘤消退和长期保护性免疫。机制上，与低亲和力野生型肿瘤相比，对高亲和力新抗原反应的过继转移初始CD8+T细胞表现出增强的细胞因子产生、更高的效应功能和持续的持久性。即使在没有功能性宿主T和B淋巴细胞的情况下，对这些高亲和力肿瘤的抗肿瘤活性仍得以保留，并且早期淋巴结（LN）归巢被发现是过继性T细胞疗法疗效的关键。研究还比较了扩增的效应记忆或干细胞样记忆T细胞与初始pmel-1 T细胞产品。在表达高亲和力新抗原的肿瘤小鼠中，干细胞样记忆细胞（而非效应记忆细胞）表现出与初始细胞相似的抗肿瘤功效和淋巴结归巢模式。这些发现揭示了不同肿瘤抗原如何塑造不同的细胞命运，并发现了T细胞在淋巴结中的归巢在形成高亲和力新抗原特异性反应中的关键作用。
引言
肿瘤靶向是过继性T细胞疗法（ACT）的基石，其中T细胞要么因其天然的肿瘤反应性而被选择，要么被工程化改造为抗原特异性受体，以在输注患者后促进肿瘤消退。T细胞受体（TCR）识别抗原呈递细胞（APC）或肿瘤上MHC分子呈递的肽段，这些抗原可来自非突变的肿瘤相关蛋白或新抗原（由肿瘤突变产生的抗原）。新抗原是癌症免疫治疗中有吸引力的靶点，因为它们通常不存在于正常组织中，理论上可减少脱靶毒性。新抗原在免疫疗法的疗效中起着重要作用，近期FDA批准的lifileucel（针对抗PD-1耐药的转移性黑色素瘤的肿瘤浸润淋巴细胞疗法）和afamitresgene autoleucel（针对转移性滑膜肉瘤患者的TCR疗法）证明了靶向肿瘤特异性抗原的T细胞在复发/难治治疗中可产生有意义的临床结果。靶向新抗原的ACT在侵袭性癌症患者中诱导了肿瘤消退，在免疫检查点阻断（ICB）疗法中，新抗原特异性T细胞富集并与改善的结局相关。新抗原肿瘤疫苗也正在与ICB和ACT联合探索以进一步放大反应。然而，这些新抗原如何影响输注T细胞产品的活化、功能和命运仍不清楚。
为在细胞疗法背景下研究新抗原反应，研究创建了使用B16F10小鼠黑色素瘤的模型。小鼠黑色素瘤中的黑色素细胞相关蛋白gp100在pmel-1 TCR转基因CD8+T细胞识别的表位内被突变为人源序列。在该模型中，pmel-1 CD8+T细胞识别野生型（WT）和突变型gp100，但对突变型KVP新抗原具有更高的亲和力。该模型系统使我们能够追踪相同的pmel-1 T细胞产品如何对具有低或高TCR亲和力的WT或突变抗原作出反应。此外，当前的ACT方案需要体外扩增T细胞以产生大量细胞；但扩增过程通常在过继转移前产生具有更大耗竭特征、更少记忆潜能和受损代谢适应性的细胞。该领域正在努力以更快的速度生成具有更多干细胞样记忆或初始样特征的T细胞。然而，尽管这些ACT产品质量有所提高，但它们向肿瘤归巢的能力及其对免疫力的相对贡献仍有待探索。为解决此问题，我们在描述的模型系统中使用初始pmel-1 T细胞，使我们能够动态分析在高亲和力新抗原或低亲和力肿瘤相关抗原背景下转移细胞的活化状态和表型。
材料与方法
研究使用了来自Jackson实验室的Pmel-1、C57BL/6和Rag1?/?小鼠，所有小鼠均按照埃默里大学机构动物护理和使用委员会指南使用。肿瘤细胞系包括来自ATCC的B16F10细胞和作为礼物的B16KVP细胞，均在完全培养基中培养。为获得初始小鼠T细胞，从pmel-1脾脏处理获取细胞，并使用EasySep Mouse Na?ve CD8+T Cell Isolation Kit分选初始T细胞。为扩增效应T细胞，pmel-1细胞在含有1 μmol/L人gp100肽和100 IU/mL rhIL2的培养基中活化7天。为扩增干细胞样记忆T细胞（TSCM）细胞，pmel-1细胞类似地活化和培养，但添加10 μmol/L idelalisib。小鼠在过继T细胞转移前1天接受4至5 Gy全身照射以进行淋巴细胞清除。对于使用初始细胞的实验，将1×106pmel-1 T细胞重悬于无菌PBS中并通过尾静脉注射转移到荷瘤C57BL/6小鼠中。细胞结合亲和力测定使用LUMICKS z-Movi系统进行。血清细胞因子分析使用Eve Technologies的小鼠细胞因子/趋化因子发现测定阵列进行。肿瘤组织在ACT后5天收集用于NanoString转录组分析。流式细胞术在Cytek Aurora系统上进行，并使用FlowJo软件分析。
结果
高亲和力新抗原识别使初始pmel-1 T细胞能够根除黑色素瘤
Pmel-1转基因CD8+T细胞是细胞治疗的临床相关模型，表达针对黑色素细胞和黑色素瘤表达的gp100抗原的TCR。在标准条件下，pmel-1 T细胞需要淋巴细胞清除、疫苗接种和IL2给药才能克服耐受机制并允许在B16F10黑色素瘤中破坏肿瘤。然而，由于与IL2给药相关的毒性以及近期证明初始和干细胞样记忆T细胞（TSCM）具有优越抗肿瘤作用的报告，我们试图评估即使在没有IL2或疫苗接种的情况下，初始抗原特异性T细胞是否也能导致肿瘤控制。使用B16F10和B16KVP模型系统，我们还能够评估这些细胞如何对B16F10和B16KVP分别表达的低亲和力EGSRNQDWL mgp100或高亲和力KVPRNQDWL hgp100抗原作出反应。
首先，从转基因小鼠脾脏富集初始pmel-1 CD8+T细胞。流式细胞术证实94%的分离细胞显示初始表型。为测试KVP突变是否增强TCR-pMHC相互作用，我们使用声学力显微镜测量了体外结合亲和力。初始pmel-1 T细胞与B16KVP靶标的结合比与B16F10靶标的结合更紧密，这验证了EGS→KVP新抗原突变增加了亲和力，并为测试初始pmel-1 T细胞如何在体内对这两种不同肿瘤产生抗肿瘤反应提供了依据。
我们接下来比较了对B16F10黑色素瘤（表达WT小鼠gp100）与B16KVP黑色素瘤（表达具有EGS→KVP突变的高亲和力新抗原形式的人gp100）的肿瘤反应。两种肿瘤在体内表现出相当的生长动力学，并且在其他方面基因相同，为评估抗原特异性T细胞反应提供了受控系统。初始pmel-1细胞未能控制B16F10肿瘤。相比之下，这些相同的细胞对B16KVP肿瘤产生了强劲反应，导致超过一半动物的肿瘤消退和持久存活。值得注意的是，在B16KVP模型中，初始T细胞即使没有外源性IL2或疫苗共同给药也有效，而这在B16F10模型中通常需要。转移的pmel-1 CD8+T细胞在转移后第5天在B16KVP肿瘤中以显著更高的频率植入，并在第14天显示出增加持久性的趋势。
为研究该疗法的持久性，我们检查了治愈的动物是否抵抗肿瘤再次攻击。先前通过初始pmel-1 ACT清除B16KVP肿瘤的小鼠在再次攻击时受到保护，而年龄匹配的、未经治疗的对照小鼠发展出侵袭性肿瘤并死于疾病。输注的pmel-1细胞在转移后100天仍可检测到，并且此时在长期存活者的血液中已大部分分化为中央记忆细胞。这些数据显示，初始pmel-1 T细胞不仅在高亲和力新抗原识别时清除肿瘤，还建立了持久的免疫记忆。
初始pmel-1疗法对抗B16KVP增强细胞因子信号、免疫细胞募集和抗原呈递
为定义支持初始T细胞对B16KVP肿瘤反应的机制，我们在T细胞转移后分析了分子和免疫学景观。T细胞转移后第5天的RNA转录谱分析揭示了在接受初始pmel-1 ACT的淋巴细胞清除动物中，B16KVP与B16F10肿瘤中超过200个差异表达基因。上调最多的前50个基因中包括与细胞因子/趋化因子信号和抗原呈递相关的基因。基因本体富集分析进一步确定了细胞活化、细胞因子反应和白细胞分化途径的过表达。在B16KVP肿瘤中上调最多的前10个基因与皮肤黑色素瘤患者的改善生存相关。
在没有ACT的情况下，只有43个基因在B16F10和B16KVP肿瘤之间差异表达，在凋亡、白细胞活化和程序性细胞死亡相关途径中适度富集。值得注意的是，在基线时在B16KVP肿瘤中富集的8个基因也在ACT的初始比较中发现富集。然而，在ACT下，这些基因在B16KVP肿瘤中相对于B16F10肿瘤的诱导增加了2到5倍。此外，虽然B16KVP肿瘤在基线时显示出免疫相关基因的轻微增加，但两种肿瘤对抗PD-1疗法反应不足，这意味着治疗效果不是来自固有的肿瘤免疫原性，而是需要转移T细胞的活性。
鉴于B16KVP肿瘤中与细胞因子信号相关的转录本富集，我们试图探索是否可以在细胞因子中观察到系统性差异。ACT后第5天收集的血清显示，与B16F10相比，荷B16KVP小鼠细胞因子广泛升高。在B16KVP背景下，IFNγ增加了300多倍，并伴有促进免疫细胞募集的细胞因子。尽管细胞因子诱导强劲，但治疗小鼠仅表现出最小的毒性，仅表现为名义上的体重减轻。
过继转移的pmel-1 T细胞介导肿瘤控制，不依赖于宿主淋巴细胞
我们接下来询问宿主免疫成分是否有助于观察到的疗效。注射后1周的基线免疫细胞组成在B16F10和B16KVP肿瘤之间似乎相似，并且在ACT后也相似。在全身照射后，虽然宿主免疫群体在两种模型中短暂减少，但剩余宿主CD8+T细胞的频率与肿瘤类型或治疗无关。
为直接测试宿主淋巴细胞是否为抗肿瘤疗效所需，我们将初始pmel-1 T细胞转移到缺乏功能性T和B细胞的Rag?/?小鼠中。ACT在清除B16KVP肿瘤和延长Rag?/?和WT宿主的生存方面同样有效，表明治疗益处主要来自转移的T细胞。
最后，为评估表位扩散，我们评估了在ACT后第100天治愈小鼠的血液、脾脏和肿瘤引流淋巴结中宿主TRP-2特异性CD8+T细胞的频率。宿主反应微乎其微，表明表位扩散有限，并且不太可能对长期疗效有显著贡献，即使在缺乏宿主淋巴细胞的情况下也能维持。
IFNγ治疗不能挽救针对低亲和力B16F10肿瘤的pmel-1疗法
我们最初假设IFNγ本身可能是观察到的抗肿瘤反应的主要贡献者，因为在ACT后B16KVP肿瘤中观察到与ACT后B16F10肿瘤以及基线相比，IFNγ的系统性显著升高。因此，我们接下来测试了外源性IFNγ是否可以挽救对低亲和力B16F10肿瘤的反应。与我们的假设相反，单独给予IFNγ或与初始pmel-1联合未能改善B16F10背景下的肿瘤控制或生存。这些发现表明，尽管IFNγ升高是ACT对B16KVP肿瘤有效反应的标志，但不足以克服B16F10肿瘤的固有抵抗。
初始T细胞快速归巢到淋巴结并在被高亲和力新抗原激活后优先扩增
由于在ACT后与趋化性和迁移相关的途径在B16KVP肿瘤中富集，我们想进一步探究转移细胞在这两种不同肿瘤类型中的迁移行为随时间的变化。转移后2天内，无论抗原如何，pmel-1 CD8+T细胞均可在小鼠的淋巴结中检测到，但尚未在肿瘤中检测到。在ACT后第4至5天，pmel-1 T细胞主要在荷B16KVP小鼠的引流淋巴结中扩增，并已开始浸润肿瘤，而它们在B16F10肿瘤中几乎不存在。在B16KVP肿瘤中，pmel-1频率随时间稳步增加，反映了持续的扩增和积累。相比之下，在所有时间点，转移细胞在B16F10肿瘤中的可检测比例均小于百分之一。
转移细胞在引流淋巴结、血液和肿瘤中的分布比较加强了这种模式。最初，pmel-1细胞在两组中定位相似。然而，到第3至4天，只有携带高亲和力新抗原肿瘤的小鼠在肿瘤中发展出大量的pmel-1群体。在荷B16F10小鼠中，初始pmel-1细胞仍局限于血液和淋巴结，促使我们进一步研究它们的表型以及获取组织迁移所需的效应特征的能力。
为评估转移细胞的活化状态，我们使用流式细胞术对其进行了纵向分析。基线表征证实富集的初始pmel-1细胞表达低水平的活化标志物，并增加干细胞标志物的表达。然而，在ACT后第4天，转移细胞在荷B16KVP小鼠的血液、肿瘤和引流淋巴结中上调了CD44。同时，CD62L表达和TCF-1表达随时间逐渐下调，与向效应记忆表型分化一致。这一发现与荷B16F10小鼠中转移细胞的表型相反，因为它们显示出减弱的CD44表达并保持较高的CD62L水平。在KVP背景下的转移细胞在所有区室中也比暴露于B16F10肿瘤的细胞增殖更旺盛。
总之，这些发现表明，初始pmel-1 T细胞快速归巢到淋巴结，但仅在被高亲和力新抗原启动时才分化为效应样细胞并广泛增殖。向效应表型的转变首先出现在引流淋巴结，并在T细胞在肿瘤内扩增时持续，突出了新抗原亲和力是ACT初始阶段早期分化和治疗效力的关键决定因素。
早期淋巴结溢出对于初始转移T细胞的抗肿瘤疗效至关重要
由于过继转移的初始pmel-1细胞首先在淋巴组织中检测到，然后才出现在肿瘤中，我们询问它们从淋巴结溢出是否为抗肿瘤功能所需。尽管先前的研究表明T细胞主要在肿瘤微环境中获得效应功能，但我们假设初始在次级淋巴器官中启动，随后溢出，对于建立持久免疫至关重要。为测试这一点，我们用FTY720治疗小鼠，FTY720是一种鞘氨醇-1-磷酸受体1拮抗剂，可阻止淋巴细胞从淋巴组织溢出。
转移的pmel-1 T细胞如预期在FTY720处理和对照小鼠的淋巴结中定位，且活力不受影响。然而，FTY720显著减少了血液中宿主和转移T细胞的存在，证实了淋巴细胞溢出的有效阻断。当我们改变FTY720治疗的时间，在ACT后第0、5或12天开始时，我们发现早期阻断对抗肿瘤疗效的影响最不利。从ACT当天开始接受FTY720治疗的小鼠与未处理的对照相比表现出快速的肿瘤进展，而后期阻断并未导致生存率的显著差异。这些发现强调早期淋巴结启动和溢出对于初始pmel-1 T细胞产生有效抗肿瘤反应是不可或缺的。
干细胞样记忆而非效应CD8+T细胞归巢到淋巴结并消退B16KVP肿瘤，与初始pmel-1细胞相似
该模型确立了未扩增的初始T细胞在体内被高亲和力新抗原启动时可以介导有效的抗肿瘤反应。然而，由于临床方案通常依赖于体外活化和IL2驱动的扩增，我们接下来想将这些细胞与更传统的ACT产品进行比较。具体而言，我们评估了三种不同pmel-1亚群的归巢、持久性和抗肿瘤潜力：初始、效应样和干细胞样记忆细胞。TSCM细胞在PI3-激酶抑制剂CAL-101存在下扩增，以生成相对于IL2扩增细胞具有优越抗肿瘤特性的中央记忆pmel-1群体。
