STAT6D419突变通过CCL17–CCR4轴重塑肿瘤微环境并介导复发/难治性弥漫大B细胞淋巴瘤治疗抵抗

《Cancer Immunology Research》：The CCL17–CCR4 Axis Is Critical for Mutant STAT6-Mediated Microenvironmental Remodeling and Therapeutic Resistance in Relapsed/Refractory Diffuse Large B-Cell Lymphoma Open Access

本文聚焦于复发/难治性弥漫大B细胞淋巴瘤(rrDLBCL)，探讨了STAT6D419功能获得性突变在介导治疗抵抗中的关键机制。研究发现，该突变导致肿瘤细胞高表达趋化因子CCL17，通过CCL17–CCR4轴大量招募CCR4+ CD4+T细胞（尤其是Th1细胞）浸润肿瘤微环境(TME)，进而赋予肿瘤对阿霉素（Doxorubicin）治疗的抵抗性。研究证实，靶向CCR4可抑制CD4+T细胞浸润，并恢复肿瘤对阿霉素的敏感性。该工作揭示了CCL17–CCR4轴是STAT6D419突变型rrDLBCL的重要治疗靶点，为临床克服治疗抵抗提供了新策略。

　　

绪论

弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）是成人最常见的淋巴瘤，一线R-CHOP方案（利妥昔单抗、环磷酰胺、阿霉素、长春新碱、泼尼松）可使60%患者获得完全缓解。然而，约30%-40%的患者会发展为复发/难治性DLBCL（rrDLBCL），预后极差。信号转导与转录激活因子6（STAT6）的D419位点功能获得性突变在rrDLBCL中富集，与不良预后相关。先前研究已发现，STAT6^D419突变导致肿瘤细胞磷酸化STAT6（pSTAT6）水平升高，并上调其下游靶基因趋化因子CCL17的表达，同时肿瘤组织中CD4⁺T细胞浸润增加。但增多的T细胞浸润的临床意义、其极化状态、以及CCL17是否驱动其募集等关键问题尚不明确。此外，STAT6^D419突变如何通过改变肿瘤微环境（TME）导致治疗抵抗的机制仍有待阐明。

STAT6^D419N-Eμ-Myc小鼠淋巴瘤模型重现了人STAT6^D419突变型rrDLBCL的关键特征

为在免疫健全环境中研究STAT6^D419突变对TME的影响，研究者构建了过表达小鼠Stat6野生型（mSTAT6^WT）或突变型（mSTAT6^D419N）的Eμ-Myc淋巴瘤细胞系，并将其注射至C57BL/6小鼠尾静脉，形成原位B细胞淋巴瘤模型。两种基因型肿瘤的生长速度和重量在疾病中期（第11天）无差异。但免疫组化与流式细胞术分析显示，mSTAT6^D419N肿瘤在疾病中期具有更高的pSTAT6表达、CCL17蛋白水平以及CD4⁺T细胞的浸润比例和绝对数量。这些特征成功模拟了人类STAT6^D419突变型DLBCL的病理特点。

mSTAT6^D419N-Eμ-Myc肿瘤中CCR4+ Th1细胞增多并呈现炎症特征

对疾病中期肿瘤浸润CD4⁺T细胞进行分型发现，mSTAT6^D419N肿瘤中，调节性T细胞（Treg）和滤泡辅助性T细胞（Tfh）未见增多，但促炎性的T辅助细胞1（Th1）的比例和数量显著增加，而抗炎性的Th2细胞无变化。更重要的是，mSTAT6^D419N肿瘤中CCR4+ CD4⁺T细胞（即CCL17的受体阳性细胞）显著增多，且Th1细胞上CCR4的表达比例和平均荧光强度（MFI）也更高。从这些肿瘤中分选出的CD19⁺肿瘤细胞进行RNA测序分析显示，mSTAT6^D419N肿瘤细胞富集了与炎症相关的基因信号通路，这与肿瘤内增多的、可产生IFNγ的Th1细胞浸润表型相一致。

mSTAT6^D419N肿瘤对CCR4+ CD4⁺T细胞具有直接趋化吸引力

体外实验证实，经IL-4刺激后，mSTAT6^D419N肿瘤细胞比mSTAT6^WT细胞产生更多的Ccl17转录本。在Transwell迁移实验中，IL-4刺激的mSTAT6^D419N细胞能吸引更多来自无瘤小鼠脾脏的CCR4+ CD4⁺T细胞，此效应可被CCR4小分子拮抗剂AZD2098阻断。为了更贴近体内复杂的TME，研究者收集了疾病中期小鼠的肿瘤上清（包含完整的TME分泌组）和脾脏CD4⁺T细胞（已受肿瘤影响）。细胞因子谱分析显示，mSTAT6^D419N肿瘤上清中CCL17及IFNγ、IL-2等Th1相关细胞因子水平更高。迁移实验表明，无论CD4⁺T细胞来源于何种基因型肿瘤小鼠，mSTAT6^D419N肿瘤上清对CCR4+ CD4⁺T细胞（包括Treg、Tfh、Th1、Th2各亚群）的趋化能力都显著强于mSTAT6^WT上清，且该趋化作用可被AZD2098抑制。这证明了STAT6^D419N肿瘤通过CCL17–CCR4轴主动招募CD4⁺T细胞。

mSTAT6^D419NEμ-Myc肿瘤对阿霉素治疗产生抵抗

尽管体外实验中，mSTAT6^D419N肿瘤细胞对阿霉素的敏感性与野生型无异，但在小鼠体内模型中却表现出明显的治疗抵抗。给予荷瘤小鼠3次3 mg/kg或单次10 mg/kg阿霉素治疗后，mSTAT6^WT肿瘤体积显著缩小甚至完全消退，而大部分mSTAT6^D419N肿瘤在治疗期间持续生长或治疗后快速复发。mSTAT6^D419N荷瘤小鼠的次要肿瘤部位（腹股沟淋巴结）复发率更高，总体生存期有缩短趋势。这表明STAT6^D419N突变通过改变TME（而非肿瘤细胞自身）赋予了体内治疗抵抗性。

靶向CCR4可逆转mSTAT6^D419N肿瘤的治疗抵抗

为验证CCL17–CCR4轴是否介导了这种抵抗，研究者将CCR4抑制剂AZD2098与阿霉素联用。结果显示，AZD2098治疗显著减少了mSTAT6^D419N肿瘤中CD4⁺T细胞的浸润，并恢复了肿瘤对阿霉素的敏感性。联合治疗组小鼠的肿瘤生长被有效抑制，生存期得以延长。这直接证明了阻断CCR4可以逆转由STAT6^D419N突变所导致的肿瘤微环境重塑及治疗抵抗。

人类rrDLBCL样本验证了CCL17–CCR4轴的空间相互作用

最后，研究通过对人类rrDLBCL患者样本进行PhenoCycler多重免疫荧光成像分析，将小鼠模型中的发现转化至临床。结果显示，与STAT6野生型样本相比，STAT6^D419突变型肿瘤样本中pSTAT6⁺肿瘤细胞与CCR4+ CD4⁺T细胞之间的空间相互作用显著增加。这为CCL17–CCR4轴在人类疾病中的功能性作用提供了直接证据。

结论与意义

本研究表明，STAT6^D419功能获得性突变通过上调CCL17的表达，激活CCL17–CCR4生物学轴，特异性招募CCR4+ CD4⁺T细胞（特别是Th1细胞）浸润肿瘤微环境。这种微环境的重塑是导致STAT6^D419突变型rrDLBCL对阿霉素产生治疗抵抗的关键机制。重要的是，靶向CCR4可以阻断这一过程，使耐药肿瘤重新敏感化。因此，CCR4成为STAT6信号过度激活的rrDLBCL患者一个极具潜力的治疗靶点，为克服这类难治性淋巴瘤提供了新的联合治疗思路。