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这篇研究综述揭示，平衡性核苷转运蛋白ENT家族的两个成员——定位于细胞膜的SLC29A1/ENT1和定位于内溶酶体的SLC29A3/ENT3——在调控细胞自噬中发挥着截然相反的作用。研究通过详实的细胞与动物实验证实，SLC29A1通过促进其共有底物腺苷（Adenosine, Ado）外流，降低胞内AMP浓度，从而抑制AMP激活的蛋白激酶（PRKAA/AMPK）磷酸化，并稳定BECN1-BCL2复合物，最终抑制自噬起始。相反，SLC29A3则促进溶酶体内Ado向胞质转运，增加AMP生成，激活PRKAA/AMPK并抑制MTOR通路，从而促进自噬。两者表达还受到自噬状态的动态、反方向调节，形成了一个精密的反馈回路。这项研究阐明了核苷转运蛋白通过调控Ado的亚细胞区隔化来差异化调节自噬这一全新机制，为理解自噬相关疾病（如代谢紊乱、心血管疾病、罕见遗传病）的病理生理学及开发靶向ENTs的治疗策略提供了新的理论依据。
引言：核苷转运与细胞自噬的未解联系
自噬是细胞内一种高度保守的降解途径，通过将胞质成分运送至溶酶体进行分解，在维持细胞代谢稳态、应对营养胁迫以及多种生理病理过程中发挥核心作用。尽管碳水化合物、蛋白质和脂质在自噬调控中的作用已被广泛研究，但核苷酸及其降解产物的贡献仍不甚明了。值得注意的是，自噬本身在维持细胞内核苷酸池、为DNA合成与修复提供前体方面也扮演关键角色。嘌呤核苷腺苷（Adenosine, Ado）是一种重要的信号分子和代谢物，研究表明其可以诱导自噬。然而，膜结合的Ado转运蛋白在自噬调控中的确切作用一直悬而未决。Ado是亲水性分子，其跨膜转运主要依赖两大类转运蛋白家族：Na+依赖的浓缩性核苷转运蛋白（SLC28A/CNTs）和Na+非依赖的平衡性核苷转运蛋白（SLC29A/ENTs）。其中，ENT家族成员因其广泛的表达和不同的亚细胞定位而可能具有非冗余的功能。本研究的核心，便是深入探究定位于细胞膜的原型转运蛋白SLC29A1/ENT1与定位于内溶酶体的SLC29A3/ENT3，如何通过差异化调控Ado的（亚）细胞区隔化，从而对细胞自噬产生截然不同的影响。
结果
1. 细胞膜SLC29A1与内溶酶体SLC29A3在基础自噬中的拮抗作用
研究首先在稳定表达SLC29A1或SLC29A3短发夹RNA（shRNA）的人胚胎肾细胞（HEK293）中观察自噬标志物。结果显示，敲低SLC29A3降低了基础自噬水平，而敲低SLC29A1则导致微管相关蛋白1轻链3B（MAP1LC3B/LC3B）的脂化形式（LC3B-II）水平升高、自噬受体SQSTM1/p62水平降低，表明自噬增强。这一相反效应在过表达实验中得到了验证：过表达SLC29A1（定位于质膜）减少了LC3B阳性点状结构（自噬体标志）的形成，降低了LC3B-II水平并增加了SQSTM1积累，提示自噬被抑制；而过表达SLC29A3（定位于核周囊泡）则增加了LC3B点状结构，提升了LC3B-II水平，表明自噬被诱导。在原代小鼠细胞中也观察到了类似关联：巨噬细胞中SLC29A3表达相对较高，自噬水平也较高；内皮细胞中SLC29A1表达占优势，自噬水平则相对较低。这些发现共同表明，SLC29A1和SLC29A3对基础自噬具有相反的调节作用：SLC29A1抑制自噬，而SLC29A3促进自噬。
2. SLC29A1抑制而SLC29A3增强自噬流
通过使用溶酶体抑制剂氯喹（Chloroquine, CQ）阻断自噬体降解来评估自噬流（autophagic flux），研究进一步确认了二者的相反作用。在SLC29A1过表达细胞中，CQ处理引起的LC3B-II累积显著少于对照细胞，说明自噬体的合成（即自噬起始）受到了抑制。即使联合使用自噬诱导剂雷帕霉素（Rapamycin, RAPA，MTOR抑制剂）和CQ，SLC29A1过表达细胞的自噬流增强反应仍然微弱。相反，SLC29A3过表达细胞在CQ处理下表现出更强的LC3B-II累积，且在RAPA+CQ处理后自噬流被强烈激活。免疫荧光和透射电子显微镜观察结果与上述生化数据一致：SLC29A1过表达细胞中自噬体稀少，而SLC29A3过表达细胞中存在大量自噬体和处于不同降解阶段的致密体（溶酶体）。因此，SLC29A1和SLC29A3对HEK293细胞的自噬流产生相反的调节：SLC29A3促进自噬起始和流，而SLC29A1抑制这些过程。
3. SLC29A底物Ado通过PRKAA/AMPK磷酸化诱导自噬
鉴于PRKAA/AMPK、MTOR和ULK1等激酶在自噬起始中的核心作用，研究接下来探究了SLC29A1介导的自噬抑制是否涉及这些通路。研究证实，细胞外Ado处理能以剂量依赖的方式诱导HEK293和HeLa细胞的自噬（LC3B-II增加）。时间进程分析显示，30 μM Ado处理可在1分钟内迅速引起PRKAA/AMPK在Thr172位点的磷酸化，并在约2.5分钟达到峰值，而LC3B-II的升高则持续更久，表明PRKAA/AMPK的激活先于LC3脂化。重要的是，Ado诱导的自噬依赖于其细胞内代谢为AMP：腺苷激酶（ADK）抑制剂5‘-iodotubercidin或PRKAA/AMPK抑制剂dorsomorphin能完全阻断Ado引起的PRKAA/AMPK磷酸化和自噬。过表达ADK增强，而过表达腺苷脱氨酶（ADA，将Ado转化为肌苷）则抑制了Ado诱导的PRKAA/AMPK激活。最关键的是，在prkaa1/prkaa2双敲除（dKO）的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）中，Ado完全丧失了诱导自噬的能力，证明Ado诱导的自噬是严格依赖AMPK的。
4. SLC29A1和SLC29A3通过调控细胞Ado区隔化来调节自噬
鉴于ENTs已知可调节Ado跨生物膜的转运，一个核心问题是：SLC29A1和SLC29A3对Ado转运和/或细胞区隔化的差异是否导致了它们对自噬的相反影响？利用放射性标记Ado和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析，研究团队发现，过表达SLC29A1的细胞在移除胞外Ado后，胞内Ado水平迅速下降，同时胞外Ado水平显著升高，表明SLC29A1促进了Ado的外排，从而降低了胞质Ado的留存。这种效应依赖于SLC29A1的转运功能，因为其药理学抑制剂（如NBMPR、dipyridamole）处理可以增加SLC29A1过表达细胞的胞内Ado积累。有趣的是，在营养成分（如核苷）耗竭的条件下（使用透析血清培养），SLC29A1的功能可能转向介导Ado内流，从而在特定代谢状态下也能促进自噬，提示其作用具有背景依赖性。
另一方面，尽管SLC29A3过表达细胞的总体胞内Ado水平与对照相似，但其自噬反应增强。通过对纯化的溶酶体组分进行LC-MS/MS分析，研究发现，在SLC29A3敲低细胞或slc29a3基因敲除（KO）小鼠的组织（心、脾、肝）溶酶体中，Ado水平显著高于对照组。这表明SLC29A3的功能是促进溶酶体内的Ado向胞质输出。当SLC29A3缺失时，Ado被困在溶酶体内，无法进入胞质被代谢为AMP以激活PRKAA/AMPK，从而导致自噬受损。相比之下，SLC29A1的缺失并不影响溶酶体Ado水平。综上所述，SLC29A1通过促进胞质Ado外排降低其胞内水平来抑制自噬，而SLC29A3则通过促进溶酶体Ado向胞质输出以增加可用于生成AMP的Ado池来促进自噬。
5. SLC29A1和SLC29A3差异化调节AMPK磷酸化
与上述Ado区隔化调控的发现一致，SLC29A1和SLC29A3对PRKAA/AMPK磷酸化的调节也截然相反。在葡萄糖饥饿条件下，SLC29A3过表达显著增强了PRKAA/AMPK的磷酸化，而SLC29A1过表达则使磷酸化水平降低超过50%。相应地，LC3B-II的水平在SLC29A3过表达细胞中升高，在SLC29A1过表达细胞中降低。用ADK抑制剂处理可普遍降低各细胞的PRKAA/AMPK磷酸化，再次证实Ado需转化为AMP才能激活AMPK。重要的是，用SLC29A1转运抑制剂（NBMPR, dipyridamole, dilazep）处理，可以逆转SLC29A1过表达引起的PRKAA/AMPK抑制，并进一步增强SLC29A3过表达细胞的PRKAA/AMPK激活。这些抑制剂也增加了LC3B-I向LC3B-II的转化。这些结果确证了SLC29A1通过其Ado转运功能来抑制PRKAA/AMPK激活和自噬，而SLC29A3则通过增加胞内区室间的Ado流动来促进这一过程。
6. SLC29A1和SLC29A3通过差异化调节PRKAA-MTOR-ULK1通路和BECN1-BCL2相互作用来调控自噬
进一步的下游机制研究表明，SLC29A3过表达增强了葡萄糖饥饿诱导的PRKAA/AMPK及其下游靶点乙酰辅酶A羧化酶（ACACA）和ULK1（Ser555）的磷酸化。同时，SLC29A3显著抑制了MTOR及其下游靶点RPS6KB/S6K和EIF4EBP1/4E-BP1的磷酸化。这些变化与SLC29A3促进自噬的角色相符。相反，SLC29A1过表达抑制了PRKAA/AMPK和ULK1（Ser555）的磷酸化，但并未显著影响MTOR通路。那么SLC29A1如何抑制自噬呢？共免疫沉淀实验揭示了一个关键机制：SLC29A1过表达增强了自噬关键蛋白BECN1与抗凋亡蛋白BCL2之间的结合。BECN1-BCL2复合物的形成会抑制BECN1的促自噬功能。因此，SLC29A1可能通过稳定BECN1-BCL2复合物来抑制自噬体的形成。SLC29A3过表达则未显著影响BECN1-BCL2相互作用。这些发现突出了SLC29A1和SLC29A3调控自噬的不同机制途径：SLC29A3通过激活PRKAA/AMPK-MTOR-ULK1轴促进自噬，而SLC29A1则通过减弱PRKAA/AMPK信号和增强BECN1-BCL2相互作用来抑制自噬。
7. 体内器官分析显示slc29a1-/-和slc29a3-/-小鼠分别具有增强和受损的自噬
为了探究生理相关性，研究分析了野生型（WT）、slc29a1-/-和slc29a3-/-小鼠的组织。从slc29a1-/-小鼠分离的MEFs显示出比WT MEFs更高的PRKAA/AMPK磷酸化和更多的LC3B点状结构，表明自噬增强。相反，slc29a3-/-MEFs的PRKAA/AMPK磷酸化和LC3B点状结构减少。在12周龄小鼠的组织（心、脾、肝）中，slc29a1-/-组织表现出更高的LC3B-II和更低的SQSTM1蛋白水平，提示自噬流增强；而slc29a3-/-组织则显示较低或相当的LC3B水平但SQSTM1明显积累，表明自噬受损。透射电镜分析进一步支持了这些发现：在CQ处理后，slc29a1-/-小鼠肝脏中积累了更多的双层膜自噬体，显示高自噬流；而slc29a3-/-小鼠肝脏即使在基础状态下也表现出更少的自噬体和含有未消化物质的增大溶酶体，提示基底自噬降解受阻。这些体内数据证实了ENTs在生理条件下对自噬的差异化调节。
8. 自噬扰动反方向调节SLC29A1和SLC29A3的表达
研究还发现，自噬与ENTs表达之间存在一个动态的双向反馈调节环。用自噬抑制剂（CQ, Bafilomycin A1）处理HEK293细胞，会导致内源性SLC29A1的转录和蛋白表达剂量依赖性增加，而SLC29A3的表达则下降。反之，用自噬诱导剂（RAPA, Torin1）处理，则导致SLC29A1表达下降和SLC29A3表达上升。在prkaa1/prkaa2 dKO的MEFs（自噬缺陷模型）中也观察到类似模式：slc29a1 mRNA上调，而slc29a3 mRNA下调。此外，在HEK293细胞中，稳定敲低SLC29A1会导致SLC29A3表达下降，反之亦然；过表达其中一种则会上调另一种的表达，表明存在补偿性调节机制。在slc29a1-/-和slc29a3-/-小鼠的组织中也观察到一定程度的核心gulation。生物信息学分析显示，slc29a3-/-小鼠肝脏组织中自噬和PRKAA/AMPK信号通路相关基因发生显著改变，而slc29a1-/-小鼠脊髓组织中的变化相对较少。这些发现表明，SLC29A1和SLC29A3不仅调节自噬，它们自身的表达也受到自噬活性的调控，形成了一个相互反馈的机制，可能有助于维持自噬稳态。
讨论与意义
本研究揭示了核苷转运蛋白SLC29A1和SLC29A3通过差异调控Ado的（亚）细胞转运和区隔化来调节自噬的关键作用及其机制。SLC29A3通过促进溶酶体Ado向胞质输出，增加AMP生成，从而激活PRKAA/AMPK并抑制MTOR，最终促进自噬。而SLC29A1则通过介导胞质Ado外排，降低可用于生成AMP的Ado池，抑制PRKAA/AMPK磷酸化，同时增强BECN1-BCL2相互作用，从而抑制自噬。SLC29A1的这种抑制作用依赖于其Ado转运功能，并受到细胞代谢状态的调节。两者在表达上还存在相互反馈和补偿性调节，与自噬活动形成动态平衡。
这些发现具有重要的生理和病理意义。SLC29A1的抑制或缺失（如在slc29a1-/-小鼠中）导致的自噬增强，可能与观察到的某些心脏保护表型相关。临床上使用的SLC29A1抑制剂（如dipyridamole, dilazep）可能部分通过增加细胞内Ado、诱导自噬来发挥其心血管保护作用。相反，SLC29A3的严重缺失导致的自噬受损，与人类SLC29A3相关疾病（如H综合征、PHID、RDD等）的严重表型（溶酶体功能障碍、组织完整性破坏、早亡）相一致。研究阐明了核苷转运蛋白动态控制Ado细胞区隔化以调节自噬这一新机制，为理解自噬相关疾病（包括代谢性疾病、缺血/再灌注损伤、感染、炎症及罕见遗传病）的病理生理学提供了新视角。靶向这些ENTs，或利用其药理学抑制剂/激动剂来调节自噬，可能为治疗这些疾病开辟新的途径。
