《BioTechniques》：3in1: an ultra-fast phage display biopanning method overcoming the biopanning bias and yielding more diverse binders
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噬菌体展示是发现治疗性抗体的经典方法，但其多轮淘选过程通常耗时长达5天，且存在扩增偏倚，导致获得的目标结合体多样性有限。本文介绍的3in1淘选技术，通过使用非变性酸洗脱并跳过轮间噬菌体扩增步骤，成功在一天内完成全部三轮淘选。此方法不仅将时间缩短了80%，而且克服了固有的扩增偏倚，可获得比传统方法高出最多6倍的独特阳性克隆，且这些克隆具有更广泛的亲和力谱。该技术适用于多种靶点的免疫库和合成库筛选，显著缩短了先导物发现周期，并减少了耗材与生物废弃物，为抗体药物的快速、多样化发现提供了高效新方案。
引言
噬菌体展示是一种强大的技术，通过将目的蛋白基因与噬菌体外壳蛋白基因（如pIII或pVIII）融合，实现外源蛋白在噬菌体表面的呈现，从而建立基因型与表型的联系。该技术能够在一个噬菌体群体中展示多种蛋白变体，形成噬菌体展示文库，部分文库的多样性超过109。凭借其产生数十亿变体的能力，噬菌体展示已成功用于发现多种新型治疗性抗体。然而，即使庞大的噬菌体文库中，也可能只含有极少能结合特定靶标的抗体。从库中分离这些稀有的结合体需要一个称为生物淘选的过程。在噬菌体展示中，生物淘选包括结合-洗脱-感染-扩增的循环。通常，一次标准的三轮淘选实验需要大约五天时间，其中每轮淘选耗时一天，随后是一天的噬菌体扩增。传统的淘选过程饱受“扩增偏倚”的困扰，即在扩增步骤中，具有繁殖优势的克隆会占据主导，导致最终获得的结合体序列多样性降低，并可能丢失一些结合力强但扩增效率不高的潜在候选分子。此外，传统方法在去除非结合体方面效率不高。
3in1淘选方法
为解决上述问题，研究人员开发了一种名为3in1的超快速噬菌体展示淘选技术。该方法的核心创新在于两点：1. 使用非变性的酸洗脱（200 mM 甘氨酸，pH 2.5）代替传统的胰蛋白酶酶切洗脱，以保持噬菌体表面展示的抗体的完整性；2. 完全省略了各轮淘选之间的噬菌体扩增步骤。如文中图1所示，3in1方法在完成一轮淘选（包括抗原结合、洗涤、酸洗脱和中和）后，直接将洗脱液用于下一轮淘选，无需进行中间感染和过夜培养扩增。这使得完整的三轮淘选可以在一天内完成，相比传统方法提速五倍，将先导物发现周期缩短了一周。该方法的理论依据在于，第一轮淘选使用了远超文库多样性的噬菌体颗粒（1012–1013）作为输入，其输出已经在一定程度上富集了结合体，且每个结合体留有多个拷贝，足以作为下一轮淘选的输入，而无需中间扩增。
3in1方法的性能评估
研究人员通过对比实验，全面评估了3in1方法与经典淘选法的性能，使用了针对两种肿瘤相关抗原（TAR01和TAR02）的免疫文库（IMM01, IMM02）以及一个合成文库（SYNTH）。
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ELISA阳性率：如文中图2(A)所示，对于所有筛选条件，3in1方法与经典方法获得的富集群体的ELISA阳性率相当，表明3in1在富集功能性结合体方面与经典方法一样高效。
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序列多样性：这是3in1方法的显著优势。对阳性克隆进行测序并分析其互补决定区3（CDR3）的独特性发现，在大多数筛选中，3in1方法获得的独特CDR3序列数量显著高于经典方法。例如，使用合成文库（SYNTH）筛选靶点TAR01时，3in1方法获得了67个独特CDR3，而经典方法仅获得10个，前者是后者的近7倍（文中图2(B)）。此外，对克隆出现频率的分析（文中图4）显示，经典方法的输出通常被少数几个优势克隆所主导，而3in1方法的输出中克隆分布更为均匀，多样性更广。这表明，省略扩增步骤有效避免了由噬菌体增殖效率差异引起的“扩增偏倚”。
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序列重叠度：如图3的维恩图所示，两种方法发现的独特CDR3序列集合重叠部分较小，表明它们倾向于筛选出不同的克隆池。这提示两种方法可能因流程差异而存在不同的选择压力或偏倚。
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亲和力范围：研究人员进一步通过生物层干涉技术（BLI）测量了结合体的解离速率（koff），以评估其亲和力。如图5和表1所示，使用免疫文库IMM02筛选靶点TAR02的结果表明，经典方法几乎只保留了慢速（koff< 10-3s-1）和中速（10-3< koff< 10-2s-1）解离的结合体，其中强结合体（慢速解离）占比34%。而3in1方法则得到了从慢速到快速（koff> 10-2s-1）的更宽范围的亲和力谱，强结合体占比为15%，其分布更为均匀。这意味着经典淘选倾向于选择性保留强结合体并剔除弱结合体，而3in1则能保留更广泛的亲和力范围的结合体。
讨论与优势
3in1技术将典型的多轮淘选时间从五天缩短至一天，大幅提升了抗体发现的效率。其成功的关键在于跳过了导致多样性损失的扩增步骤，并采用非破坏性的酸洗脱来保持噬菌体活性。实验证明，该方法在阳性率上与经典方法持平，在序列多样性上通常更优。两种方法在获得的克隆序列和亲和力分布上各有特点：经典方法在筛选高亲和力结合体方面可能更具优势；而3in1方法则能提供多样性更丰富、亲和力谱更广的克隆池，这对于依赖多价结合（avidity）的药物设计（例如，设计可区分高/低抗原密度组织的多价分子）尤为有利。此外，3in1方法减少了80%的人力投入，并显著降低了实验过程中产生的生物和塑料废物。
结论与展望
3in1是一种强大的噬菌体展示淘选方法，可在一天内完成三轮淘选。它在大多数筛选中能产生与经典方法相当的阳性率，并通过克服经典淘选固有的扩增偏倚，提供了更高的序列多样性。该方法速度更快、劳动强度更低，且更环保。经典淘选主要保留中、高亲和力结合体，而3in1淘选能产生强、中、弱各种亲和力的结合体，为不同的应用场景提供了更多选择。未来，将3in1淘选与下一代测序（NGS）技术及高质量文库相结合，有望进一步加速先导物发现，获得具有更广泛生物物理和功能多样性的抗体候选分子。
