基于ZAKα-p38通路抑制铁死亡：M2巨噬细胞外泌体改善支气管肺发育不良的新机制

《Antioxidants》：M2 Macrophage-Derived Exosomes Ameliorate BPD by Inhibiting Ferroptosis via Suppression of the ZAKα-p38 Signaling Pathway Yuhan Pu, Mingyue Lv, Ru Yan, Honglian Zhang, Lihui Yu, Weilai Jin, Le Zhang, Zhiwei Yu and Yahui Zhou

本研究揭示了M2巨噬细胞来源的外泌体（M2-Exo）在支气管肺发育不良（BPD）中的保护作用新机制。通过体内外BPD模型，作者发现M2-Exo能够有效抑制高氧或脂多糖（LPS）诱导的肺泡上皮（AT）细胞铁死亡（Ferroptosis），其机制在于通过稳定核糖体，进而抑制ZAKα-p38信号通路的激活。该研究为BPD的抗氧化治疗提供了新的策略和分子靶点。

　　

1. 引言

支气管肺发育不良（Bronchopulmonary dysplasia, BPD）是早产儿常见的肺部疾病，高氧诱导的氧化应激和铁死亡是导致肺泡上皮（Alveolar epithelial, AT）细胞损伤和肺泡发育受损的关键病理机制。肺泡巨噬细胞（Alveolar macrophages, AMs）与AT细胞之间的相互作用在肺泡发育中至关重要。M2型巨噬细胞具有抗炎和修复特性，其分泌的外泌体（Exosomes, Exo）作为细胞间通讯载体，在调节氧化应激相关疾病中具有潜在保护作用，但其通过调控铁死亡在BPD中发挥作用的分子机制尚不明确。

2. 材料与方法

研究使用了小鼠肺泡上皮细胞系（MLE-12）和肺泡巨噬细胞系（MH-S）。通过添加白细胞介素-4（IL-4）诱导M0巨噬细胞向M2表型极化，并利用外泌体提取试剂盒从M2巨噬细胞培养上清中分离出M2来源的外泌体（M2-Exo）。通过透射电镜（Transmission electron microscopy, TEM）、纳米颗粒追踪分析（Nanoparticle tracking analysis, NTA）以及检测外泌体标志物CD63和TSG101对M2-Exo进行鉴定。分别采用高氧（85% O₂）或脂多糖（Lipopolysaccharide, LPS）刺激构建体外AT细胞损伤模型。在体内部署了两种新生Sprague-Dawley大鼠BPD模型：LPS诱导模型（每日腹腔注射LPS）和高氧诱导模型（暴露于85% O₂）。实验组在建模的同时腹腔注射M2-Exo进行干预。通过CCK8法检测细胞活力，流式细胞术检测细胞凋亡和活性氧（Reactive oxygen species, ROS）水平，试剂盒检测丙二醛（Malondialdehyde, MDA）含量和细胞内Fe²⁺水平，Western Blot和实时荧光定量PCR（qPCR）检测相关蛋白及mRNA表达，苏木精-伊红（H&E）染色观察肺组织病理变化，并进行RNA测序（RNA-seq）及生物信息学分析。

3. 结果

3.1. M2巨噬细胞及M2-Exo的成功获取与鉴定

IL-4成功诱导M0巨噬细胞分化为M2型，表现为炎症因子IL-1β和IL-6表达下降，抗炎因子精氨酸酶-1（Arginase-1, Arg-1）和CD206表达上升。提取的M2-Exo在电镜下呈典型双层膜结构，粒径约为130.8 ± 2.7 nm，高表达外泌体标志物CD63和TSG101。DIR荧光标记显示M2-Exo可被细胞摄取，且腹腔注射后能靶向递送至肺组织。

3.2. M2-Exo减轻高氧/LPS诱导的AT细胞损伤，但不完全依赖抑制凋亡

M2-Exo干预显著恢复了被高氧或LPS抑制的MLE-12细胞活力，并上调了AT1细胞标志物水通道蛋白5（AQP5）和AT2细胞标志物表面活性蛋白C（Surfactant protein C, SPC）的表达。虽然M2-Exo减轻了高氧诱导的细胞凋亡，但对LPS诱导的凋亡影响有限，且对凋亡关键执行蛋白cleaved-caspase3的含量无明显影响，提示其保护作用可能不主要依赖于抑制凋亡。

3.3. M2-Exo抑制高氧/LPS诱导的铁死亡

M2-Exo处理显著降低了高氧或LPS引起的ROS和MDA水平升高，缓解了线粒体内的铁积聚，并逆转了谷胱甘肽过氧化物酶4（Glutathione peroxidase 4, GPX4）表达的下降。这些指标的变化是铁死亡的典型特征，表明M2-Exo能够抑制铁死亡。

3.4. M2-Exo在体内抑制铁死亡并改善BPD表型

在LPS和高氧诱导的BPD大鼠模型中，M2-Exo治疗改善了幼鼠的体重下降，减轻了肺组织的病理损伤（如肺泡简化、间隔增宽），增加了增殖标志物Ki67的表达，并恢复了AQP5和SPC的表达。同时，肺组织线粒体内铁积聚减少，GPX4表达上调，证实M2-Exo在体内同样能通过抑制铁死亡来改善BPD。

3.5. M2-Exo可拮抗铁死亡诱导剂的作用

使用铁死亡激活剂RSL3进一步验证，发现M2-Exo能够逆转RSL3导致的GPX4表达抑制和细胞活力下降，并减轻RSL3引起的MDA含量升高和铁积聚，直接证明了M2-Exo具有抑制铁死亡的能力。

3.6. M2-Exo抑制铁死亡的机制涉及核糖体及ZAKα-p38通路

RNA-seq分析显示，M2-Exo干预后差异表达基因显著富集于核糖体和mTOR信号通路。进一步实验排除了mTOR通路的核心作用。研究发现，高氧或LPS处理可上调核糖体应激反应核心调控因子ZAKα的表达并促进p38 MAPK的磷酸化（p-p38），而M2-Exo干预能显著抑制ZAKα的表达和p38的磷酸化。动物实验中也观察到一致的结果。

3.7. 过表达ZAKα可拮抗M2-Exo的保护作用

在AT细胞中过表达ZAKα，模拟了核糖体应激激活状态。结果显示，ZAKα过表达削弱了M2-Exo对细胞活力的提升作用，部分逆转了M2-Exo对ROS、MDA水平的降低作用以及对GPX4表达的上调作用。这证实了ZAKα-p38通路是M2-Exo发挥抗铁死亡和细胞保护作用的关键下游环节。

4. 讨论

本研究阐明了M2-Exo在BPD中的保护性作用新机制。BPD的发病涉及高氧和炎症等多重因素，导致AT细胞损伤。本研究发现M2-Exo能有效促进AT细胞增殖并修复损伤。尽管凋亡参与其中，但M2-Exo的抗凋亡作用并不完全一致，提示存在其他关键机制。近年来，铁死亡被证实参与BPD的病理过程。本研究证实，M2-Exo能显著抑制高氧和LPS诱导的铁死亡，而激活铁死亡则会抵消其保护效应。

机制层面，研究通过RNA-seq将焦点引向核糖体通路。核糖体损伤可激活其下游的ZAKα-p38信号通路。高氧/LPS产生的ROS可引起核糖体损伤，进而激活ZAKα/p38，而M2-Exo能够抑制这一过程。ZAKα的过表达实验反向验证了该通路的核心地位。因此，M2-Exo可能通过稳定核糖体，抑制ZAKα-p38信号通路的激活，从而阻断铁死亡，实现对AT细胞的保护和BPD的改善。

5. 结论

综上所述，本研究首次揭示M2-Exo可通过抑制ZAKα-p38信号通路，缓解高氧或炎症诱导的AT细胞氧化应激和铁死亡，从而改善BPD。这为了解肺泡巨噬细胞与上皮细胞间的外泌体通讯提供了新视角，并为BPD的抗氧化治疗提供了新的策略和分子靶点。未来研究需进一步明确M2-Exo中稳定核糖体的具体活性成分。