《Nutrients》：Dietary Habits and Age–Health Gradient Among Older Adults in a Region of Japan
Makoto Hazama,
Hiroyo Kagami-Katsuyama,
Naohito Ito,
Tairo Ogura,
Mari Maeda-Yamamoto and
Jun Nishihira
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本研究利用数据非依赖采集(DIA)质谱技术，对早产与足月母亲在不同泌乳阶段(产后早期与第5周)的母乳进行定量蛋白质组学比较。研究发现，差异蛋白质并非固定，而是随泌乳阶段发生特异性变化，其中免疫相关蛋白（如IGHG4、S100A8/A9）的差异最为显著。结果表明，在比较人乳蛋白质组时，泌乳阶段是必须考虑的关键背景变量。
引言：早产婴儿营养挑战与人乳蛋白质组动态
早产与婴儿的代谢、胃肠及免疫系统不成熟导致的营养脆弱性增加相关。因此，出生后最佳营养是早产儿早期护理的关键，而人乳因其独特的营养和生物活性特性，始终被认为是肠内喂养的首选。人乳含有复杂的蛋白质动态阵列，参与免疫调节、炎症信号传导、组织发育和宿主防御。其成分并非一成不变，而是随着泌乳进程而变化，反映了生理上的成熟以及对婴儿需求的响应。这些时间性变化在早产背景下尤为相关。然而，目前尚不清楚早产分娩是与稳定、依赖分娩的蛋白质组特征相关，还是与跨泌乳阶段的时间特异性数量调控相关。本研究旨在通过高覆盖度的定量蛋白质组学方法，探究早产与足月人乳在预定义的泌乳时间点上的蛋白质组差异是稳定的还是阶段特异性的。
材料与方法：前瞻性研究与定量DIA质谱分析
研究人群
本研究前瞻性纳入了40名泌乳母亲，分为早产婴儿（<32孕周）母亲组和足月婴儿（37-42孕周）母亲组，每组20人。每位母亲在两个预定义时间点提供了配对乳汁样本：泌乳早期（产后前10天）和泌乳后期（产后第5周）。
样本制备与蛋白质组学分析
为最小化分析干扰，样本首先通过离心去除脂质层，并利用超速离心澄清获得乳清。通过基于过滤辅助样品制备(FASP)方案的蛋白酶解处理，获得肽段。研究采用数据非依赖采集(DIA)质谱策略，以实现对复杂生物流体的可重复定量分析。通过构建项目特异性谱图库，借助Spectronaut软件进行数据分析，在肽段和蛋白质水平上以1%的错误发现率(FDR)进行过滤。采用Storey方法进行FDR校正的独立样本t检验，以q值<0.05且绝对倍数变化>1.5为阈值，判定蛋白质存在显著差异丰度。
研究结果：蛋白质组差异具有阶段特异性
研究人群特征
基线特征显示，两组母亲在多数人口学和临床特征上相似，但早产组的孕期增重显著更低，且产前皮质类固醇预防治疗更为常见，这是潜在的混杂因素。
蛋白质组鉴定概况
平均每个样本鉴定到662种蛋白质，其中169种在所有样本中均被稳定定量。
泌乳早期的差异蛋白质组
在泌乳早期，两组间仅有10种蛋白质存在显著差异，且变化方向是双向的。早产母乳中，与铁处理和免疫调节相关的蛋白质（如铁蛋白重链、HLA II类组织相容性抗原γ链）丰度更高，而部分免疫球蛋白相关蛋白（如免疫球蛋白重链恒定区γ4IGHG4）的丰度则较低。差异蛋白的功能主要富集于免疫系统相关过程。
泌乳后期的差异蛋白质组
到泌乳后期（第5周），差异蛋白质的数量增加至19种，且绝大多数在早产母乳中呈现更高的丰度。最显著的变化是钙卫蛋白亚基S100A8和S100A9，其在早产母乳中的丰度是足月母乳的五倍以上。其他免疫相关蛋白，如S100A6和多种免疫球蛋白可变区组分，也显示出1.6至2.7倍的增加。而IGHG4等少数蛋白在早产母乳中持续呈低水平。多变量分析（偏最小二乘判别分析PLS-DA）也显示，在泌乳早期和后期，早产与足月母乳样本都能被清晰地区分开。
讨论：免疫蛋白主导的阶段性差异
关键蛋白质的生物学解释
- 1.
免疫相关蛋白与免疫球蛋白：免疫球蛋白相关蛋白是观察到的蛋白质组差异的重要组成部分。其中，IGHG4在两个泌乳阶段均在早产母乳中持续下调。IgG4与调节性或耐受性免疫反应相关，其减少应被视为免疫球蛋白库的选择性改变，而非整体免疫保护功能的损伤。
- 2.
先天免疫与炎症反应相关蛋白：钙卫蛋白复合物（S100A8/A9）显示出强烈的阶段依赖性差异。它既具有抗菌特性和营养免疫（通过金属螯合）作用，也是一种常用的炎症活性生物标志物。其在早产母乳后期的显著升高，可能反映了母体系统或乳腺的炎症活动。
- 3.
铁代谢与适应性功能：铁蛋白重链是另一个具有明确阶段依赖性差异的蛋白。母乳中的铁蛋白被认为具有铁结合和调节氧化应激的双重作用。其丰度的改变可能反映了母乳中铁处理的适应性调节，而非总铁供应的差异。
泌乳阶段作为关键背景变量而非主要驱动因素
对差异蛋白质组的解读必须考虑泌乳阶段对人乳成分的强大影响。本研究发现，差异蛋白质的模式和幅度在泌乳阶段间发生了改变，表明观察到的是一种阶段特异性调控，而非一个稳定的蛋白质组表型。因此，在解释人乳蛋白质组数据时，泌乳阶段是一个必须考虑的关键背景因素，应避免在异质性泌乳窗口中进行横断面比较。
研究的优势与局限性
本研究的主要优势在于其配对取样设计和定量DIA蛋白质组学分析方法，最大程度减少了人乳蛋白质组学中已知的显著的个体间差异，并实现了蛋白质组水平的稳健比较。研究的局限性包括样本量有限、未进行功能验证、未分析组内跨泌乳阶段的纵向变化，且未能对一些潜在混杂因素（如产前皮质类固醇暴露、分娩方式）进行统计学校正。
结论与未来方向
本研究结论表明，早产与足月母亲母乳之间的蛋白质组差异并非静态，而是随着泌乳阶段变化。研究揭示了一种主要由免疫相关蛋白构成的、有限的蛋白质集合的阶段性特异性调控，而非与早产分娩相关的单一稳定蛋白质组表型。这强调了泌乳时间是解释人乳蛋白质组数据的一个关键背景因素。未来需要结合纵向设计和功能测定的研究，以阐明这种阶段性蛋白质调控的生物学意义。当前，这些发现主要对母乳生物学研究具有意义，尚不足以支持改变现有的新生儿喂养或强化策略。
