窄鳕鱼精寡肽的结构特征及其通过AMPK/PGC-1α介导的能量代谢调节在运动小鼠中的抗疲劳活性

《Nutrients》：Structural Characteristics of Theragra chalcogramma Milt Peptides and Their Anti-Fatigue Activity via AMPK/PGC-1αMediated Energy Metabolism Regulation in Exercised Mice Jiangjiang Zhang, Yulian Ding, Shanshan Zhang, Tingting Yang, Chaozhong Fan, Xiaoyun Zhu and Hu Hou

本研究发现，从窄鳕鱼（Theragra chalcogramma）鱼精中制备的活性肽（TMP）在运动性疲劳小鼠模型中展现出显著的抗疲劳潜力。通过生化指标、组织病理学及分子机制研究揭示，TMP可降低血清尿素氮（BUN）和血乳酸（BLA）水平，提升肌肉糖原（MG）储备，增强抗氧化酶（SOD、GSH-Px）活性，并保护肌肉组织。其核心机制在于激活AMPK（AMP-activated protein kinase）/PGC-1α（peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator-1α）信号通路，促进线粒体生物发生，从而调控能量代谢稳态，为开发天然抗疲劳功能食品提供了科学依据。

　　

结构特征、抗疲劳效应与机制研究：窄鳕鱼鱼精肽的深入探索

引言

运动性疲劳，通常指因肌肉运动超过其极限而导致机体工作能力持续下降的一种生理现象。其产生与氧化应激、代谢产物积累、能量耗竭等多种因素有关。其中，AMP激活的蛋白激酶（AMPK）在能量代谢调控中扮演核心角色。目前一些抗疲劳药物可能引起心血管和神经系统副作用，因此人们愈发关注副作用更少的天然替代品。从蛋白质酶解获得的多肽已被证明具有抗疲劳等多种生物活性，海洋生物则是此类活性肽的重要来源。窄鳕鱼（Theragra chalcogramma）是一种重要的远洋经济鱼类，其加工过程中产生的副产物——鱼精约占鱼体重量的7%，富含必需氨基酸、核酸等营养成分，但其鱼腥味导致利用率不高。鱼精来源的肽已被证明具有增强胰岛素敏感性、抗肥胖、降血压、抗氧化等多种健康益处。然而，窄鳕鱼鱼精肽（TMP）的具体结构特征及其抗疲劳机制仍不清楚。本研究旨在表征TMP的结构，评估其抗疲劳活性，并探究其通过AMPK/PGC-1α信号通路调控能量代谢的潜在机制。

TMP的制备与结构表征

研究首先通过多种蛋白酶（碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶）对窄鳕鱼鱼精进行酶解，并以氮回收率（NR）和水解度（DH）为指标筛选最佳酶。结果表明，碱性蛋白酶（Alk）和风味蛋白酶（Fla）的NR和DH高于其他三种酶。进一步优化复合酶解条件发现，当Alk与Fla的酶添加比例为1:5时，DH和NR达到最优，此条件下的酶解产物被定义为TMP，用于后续研究。

对TMP的结构分析显示，其91.6%的肽段分子量低于1000 Da，且以200-600 Da为主。氨基酸组成分析表明，TMP富含支链氨基酸（BCAA，占18.2%），包括亮氨酸（Leu，9.0%）、缬氨酸（Val，5.8%）和异亮氨酸（Ile，3.7%）。此外，TMP还含有高比例的谷氨酸（Glu，11.4%）、精氨酸（Arg，6.2%）和天冬氨酸（Asp，7.2%）。这些氨基酸被认为在延缓疲劳和抗氧化方面具有重要作用。傅里叶变换红外光谱（FT-IR）和圆二色光谱（CD）分析揭示了TMP的二级结构组成，主要为无规卷曲（29.5%）和β-转角（29.5%）。通过质谱分析，从TMP中鉴定出154条特征肽序列，其中64%的肽段含有Glu、Arg或Asp，有43条肽段（肽段排名>0.5）可能具有较高的生物活性潜力。

分子对接预测TMP与AMPK的相互作用

作为一种计算工具，分子对接常被用于预测配体与蛋白质之间的结合亲和力。AMPK是一个三聚体复合物，通过其γ亚基结合AMP、ADP和ATP，参与能量代谢相关信号通路。研究对TMP中预测的43条潜在活性肽与AMPK（PDB ID: 4ZHX）进行了分子对接。结果显示，这些肽与AMPK的结合能范围在-9.1至-5.5 kcal/mol之间，表明受体与配体之间存在稳定的相互作用。选择其中结合亲和力较高的两条代表性肽TPPR和YPDR（均含Arg）进行详细作用力分析，发现它们主要通过范德华力和氢键与AMPK的γ亚基结合，并可与Asp317、Ser316、Ala227等关键氨基酸残基形成氢键。这些氨基酸残基对于AMP与AMPK γ亚基的相互作用至关重要。分子对接结果预测TMP可能通过激活AMPK来调节下游信号分子的表达，从而缓解疲劳，但这仅为预测性结果，需体内实验进一步验证。

TMP对运动小鼠的抗疲劳作用评估

通过建立运动诱导疲劳的小鼠模型，评估了TMP的抗疲劳效果。力竭游泳实验表明，与对照组相比，口服TMP可显著延长小鼠的力竭游泳时间，低剂量（TMP-L， 400 mg/kg）和高剂量（TMP-H， 800 mg/kg）组分别延长了45.7%和59.2%。

在主要生化指标方面，TMP干预显著降低了运动后小鼠血清中的血乳酸（BLA）和血尿素氮（BUN）水平，并增加了肌肉糖原（MG）含量，但对肝糖原（LG）含量无显著影响。这表明TMP可能通过影响骨骼肌中特定的能量代谢途径来调控糖原补充效率。在氧化应激方面，TMP处理显著提升了小鼠血清和肌肉中谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和超氧化物歧化酶（SOD）的活性，并降低了丙二醛（MDA）的积累，显示出抗氧化特性。

针对肌肉损伤的研究发现，力竭游泳导致对照组小鼠肌细胞排列紊乱、结构完整性受损，而TMP处理组（特别是高剂量组）的肌纤维结构得到改善，排列更紧密有序。血清肌酸激酶（CK）和乳酸脱氢酶（LDH）是公认的肌肉损伤标志物。TMP干预显著降低了血清中CK和LDH的水平，同时上调了肌肉组织中的CK和LDH含量，表明TMP减少了运动导致的酶外漏，对肌肉组织具有保护作用。

TMP通过AMPK/PGC-1α通路调控能量代谢的机制

能量代谢研究显示，TMP补充剂显著增加了运动小鼠骨骼肌中的ATP水平和高剂量组的Na⁺-K⁺-ATP酶活性，但对Ca²⁺-Mg²⁺-ATP酶水平无显著影响。在分子机制层面，qPCR和ELISA分析表明，TMP处理显著上调了骨骼肌中AMPK、PGC-1α、核呼吸因子1（NRF1）、线粒体转录因子A（TFAM）、Sirtuin 1（SIRT1）和细胞色素C（Cyt c）的mRNA表达水平，并提升了AMPK和PGC-1α的蛋白表达。

其可能的作用机制通路如图所示：TMP补充上调了AMPK的表达，AMPK的激活进而促进了SIRT1的表达，SIRT1通过去乙酰化作用进一步增强了PGC-1α的转录活性。活化的PGC-1α与NRF1相互作用，共同促进TFAM和Cyt c等下游靶基因的表达，从而增强线粒体生物发生和功能，维持能量代谢稳态，最终改善小鼠的疲劳状态。这些结果与肌肉组织中ATP、Na⁺-K⁺-ATP酶和Ca²⁺-Mg²⁺-ATP酶活性的观察结果相一致。

研究的局限性

尽管取得了积极发现，但本研究存在一些局限性。首先，虽然TMP主要由低分子量肽组成，理论上有利于膜渗透性，但缺乏关于其胃肠稳定性和肠道吸收的直接实验证据，且分子对接推导的机制解释应被视为假设生成。其次，6周龄小鼠在肌肉适应性、消化功能和恢复能力方面与成年人类存在差异，这可能影响肽的吸收和体内功效。因此，尽管结果支持TMP作为缓解疲劳的新型功能性食品成分的潜力，但仍需在人体受试者中进行进一步验证以确认其有效性和最佳使用剂量。

结论

本研究从窄鳕鱼鱼精中制备了含有18.2% BCAA且91.6%分子量低于1000 Da的TMP。在运动性疲劳小鼠模型中，TMP表现出延长力竭游泳时间、降低代谢产物积累、减轻氧化应激水平、增加肌肉糖原储备、保护肌肉组织免受损伤等多种抗疲劳效应。其作用机制与上调AMPK/PGC-1α信号通路表达，促进线粒体生物合成，从而增强运动耐力有关。因此，TMP有潜力被开发为一种具有高抗疲劳活性的新型功能性食品。