《International Journal of Molecular Sciences》：Vitamin D Receptor Signaling and Ligand Modulation: Molecular Mechanisms and Therapeutic Implications
Tram Thi-Ngoc Nguyen,
Kouki Nojiri,
Tomohiro Kurokawa,
Takahiro Sawada,
Yoshiaki Kanemoto and
Shigeaki Kato
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本文探讨了水醇香蜂草提取物（MOE）对高脂高糖饮食（HFHSD）诱导的肥胖大鼠模型在焦虑、体重及葡萄糖稳态方面的潜在调控作用。研究采用非靶向代谢组学（Untargeted Metabolomics）技术，揭示了MOE补充剂可显著影响血浆中的胆汁酸（Bile Acid）生物合成以及下丘脑的磷酸戊糖（Pentose Phosphate Pathway, PPP）途径，为理解MOE发挥抗焦虑、抗肥胖及改善糖代谢的多靶点作用机制提供了新见解，强调了其在营养干预中的潜在应用价值。
1. 引言
在伴侣动物中，慢性应激是导致行为障碍的主要因素之一。在民族兽医学实践中，植物性添加剂是管理犬只此类障碍的方法之一。其中，香蜂草提取物（Melissa officinalisextract, MOE）因其在动物和人类中的镇静和抗焦虑作用而被广泛报道。尽管其抗焦虑效果已得到证实，但其潜在的作用机制尚不完全清楚。此前的研究多采用假设驱动的研究方法，例如探究其对乙酰胆碱受体的调节或对γ-氨基丁酸（GABA）系统的影响。然而，基于假设的研究虽然强大，但可能忽略全局性的系统变化。非靶向代谢组学作为一种广谱的探索性方法，能够提供复杂系统的整体概览，识别意外的生物标志物，并为作用机制提供新的见解。本研究团队之前的研究已在犬模型中证实了MOE的抗焦虑效果，并发现血浆代谢组中胆汁酸生物合成途径受到影响。由于无法在犬只身上进行脑组织采样，研究人员通常依赖经过验证的啮齿动物模型来检验从犬类研究中得出的机制假说。因此，本研究选用大鼠作为实验模型，以便获取脑组织进行分析。为了增加模型的敏感性，并因为已知代谢紊乱会增强对压力相关行为的易感性，本研究让一部分大鼠接受饮食诱导的肥胖方案。肥胖确实与啮齿类动物焦虑和抑郁样行为的脆弱性增加有关。在此背景下，本研究旨在评估水醇MOE补充剂对肥胖大鼠的影响，重点关注下丘脑，以深入了解MOE与其抗焦虑作用相关的行动模式。首先评估了MOE对高脂饮食大鼠体重、行为和葡萄糖耐量的影响。随后，采用非靶向代谢组学方法对血浆和下丘脑组织进行探索性研究，以识别潜在的生物标志物，并突出受补充剂影响的代谢途径。
2. 结果
2.1. 肥胖模型验证
大鼠被喂食高脂高糖饮食（HFHSD）12周。结果显示，HFHSD在整个饮食期间影响了体重，从第5周开始观察到显著增加，并持续到第12周。与标准饮食（SD）组相比，HFHSD大鼠的最终体重增加了29%。此外，HFHSD导致大鼠的体重指数（BMI）、肥胖指数（AI）和腹围（AC）显著增加。口服葡萄糖耐量试验（OGTT）显示，HFHSD大鼠的血糖水平在给予葡萄糖后15分钟内升高至约170 mg/dL，虽然在120分钟时下降并稳定在150 mg/dL左右，但仍高于SD组。HFHSD大鼠的曲线下面积（AUC）也显著大于SD组。这些发现共同证实，为期12周的HFHSD方案成功建立了一个具有预期代谢改变（即葡萄糖耐量受损）的稳健肥胖模型。
2.2. MOE对体重的影响
在12周的实验中，体重监测显示，从饮食第一周开始，HFHSD组的体重就显著增加。与SD饮食组相比，体重增加持续且在整个12周内保持显著。相比之下，虽然补充了MOE的HFHSD大鼠（HFHSD MOE）的体重似乎低于未补充的HFHSD大鼠，但这种差异没有统计学意义。
2.3. 使用高架十字迷宫（EPM）进行行为分析
接下来，使用高架十字迷宫（EPM）评估了香蜂草提取物（MOE）在HFHSD大鼠中的抗焦虑效果。EPM测试基于在开放臂和封闭臂中花费的时间和移动的距离进行评估，在封闭臂中花费更多时间表明更高的焦虑，而探索开放臂则反映较低的焦虑。结果表明，HFHSD增加了在开放臂中花费的时间和距离，同时减少了在封闭臂中的时间和距离；然而，这些差异没有统计学意义。同样，与HFHSD组相比，在HFHSD大鼠中补充MOE在这些参数上没有产生统计学上的显著差异。
2.4. MOE对葡萄糖稳态的影响
口服葡萄糖耐量试验（OGTT）结果显示，与标准饮食组相比，HFHSD组从大约15分钟起血糖水平升高。这种升高在随后的时间点持续存在，在45、60和120分钟时仍然显著。虽然补充MOE导致T0时刻的血糖水平降低，但在其他时间点未观察到显著差异。AUC的测定显示，HFHSD大鼠的AUC值显著高于SD大鼠。补充MOE的HFHSD大鼠的AUC与单独HFHSD组相比有所降低。
2.5. 代谢组学分析
2.5.1. 多变量分析
采用正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）作为多变量方法来识别比较组之间的差异。首先，比较SD和HFHSD组以评估HFHSD对大鼠的影响。结果显示，喂食HFHSD的大鼠与维持SD的大鼠之间存在显著的代谢差异。血浆和脑样本中疏水提取物（HPO）和亲水提取物（HPI）的OPLS-DA分析显示了组间分离。置换测试验证了这些OPLS-DA模型的可靠性。
随后，对补充了MOE的HFHSD大鼠（HFHSD MOE）和仅接受HFHSD的大鼠进行了比较。OPLS-DA的多变量方法显示，在脑和血浆样本的HPO和HPI提取物中，HFHSD和HFHSD MOE组的代谢组存在差异。置换测试也确保了模型的稳健性。这些发现表明，MOE补充影响了HFHSD大鼠的代谢组。
2.5.2. 对代谢途径的影响
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血浆样本
应用两个参数（变量重要性投影（VIP）> 1 且 p < 0.05）来识别比较组之间显著不同的特征。比较SD和HFHSD大鼠，通过富集途径分析使用SMPDB（小分子途径数据库）揭示出血浆样本中一个受影响的途径：胆汁酸生物合成，有四个重叠代谢物。基于大鼠京都基因与基因组百科全书（KEGG）途径的途径分析揭示了类似途径，最受影响的是初级胆汁酸生物合成，其次是牛磺酸和亚牛磺酸代谢、鞘脂代谢和甘油磷脂代谢。
在HFHSD大鼠补充MOE的情况下，比较HFHSD和HFHSD MOE组揭示了受MOE补充影响的不同代谢途径。在血浆样本中，富集分析显示一个显著受影响的途径：胆汁酸生物合成，有三个重叠代谢物。另一方面，基于大鼠KEGG途径的途径分析发现两个途径显著受影响：甘油磷脂代谢是最受影响的，其次是嘧啶代谢。
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脑样本
对脑样本采用相同的方法。比较HFHSD大鼠和补充MOE的HFHSD大鼠（HFHSD MOE）显示，MOE补充影响了几条与磷酸戊糖（PPP）和能量代谢途径相关的代谢途径。受影响最严重的途径是磷酸戊糖途径和淀粉与蔗糖代谢。此外，其他四个相关途径也发生了相当大的改变：糖酵解、甘油脂代谢、果糖和甘露糖降解以及糖异生。途径分析强调了一个受MOE补充显著影响的途径。发现磷酸戊糖途径发生了改变。
3. 讨论
植物提取物的一个主要优势在于其富含生物活性化合物，能够通过多种生化途径产生一系列生理效应。在本研究中，使用非靶向代谢组学方法在高脂高糖饮食（HFHSD）大鼠模型中探索了香蜂草（MOE）的作用。本研究是一项后续研究，旨在更深入地了解MOE抗焦虑作用的机制。研究结果显示，MOE对HFHSD大鼠的体重有轻微影响，但变化无统计学意义。在高架十字迷宫（EPM）测试中，MOE并未改善HFHSD大鼠的焦虑行为。然而，口服葡萄糖耐量试验（OGTT）结果显示，补充MOE的HFHSD大鼠血糖水平总体降低，曲线下面积（AUC）显著减小，表明MOE改变了整体的血糖反应。
非靶向代谢组学分析显示，HFHSD影响了大鼠的几条途径，主要是胆汁酸（BA）合成以及牛磺酸和亚牛磺酸代谢，同时也影响了脂质代谢，特别是鞘脂和甘油磷脂。MOE补充后，血浆样本分析显示对胆汁酸生物合成、甘油磷脂和嘧啶代谢有影响。观察到的结合胆汁酸减少可能有助于其抗肥胖作用。结合胆汁酸影响肥胖、能量代谢和葡萄糖调节，并与焦虑有关。MOE的抗焦虑作用可能涉及对其的调节。此外，MOE补充影响了甘油磷脂代谢，特别是溶血磷脂。这些结果与先前的研究一致，显示了胆汁酸和脂质代谢在调节葡萄糖水平、肥胖和焦虑相关行为中的作用。
据我们所知，目前还没有研究调查香蜂草对下丘脑代谢组的影响。有趣的是，在本研究中，MOE给药影响了与磷酸戊糖（PPP）和能量代谢途径相关的几条代谢途径。补充MOE降低了HFHSD喂养大鼠的血糖水平。在大脑中，葡萄糖是主要的能量来源。MOE补充后葡萄糖耐量的改善可能因此改善大脑（包括下丘脑）的葡萄糖摄取，支持ATP生成、神经递质生物合成、氧化应激管理和认知功能。在HFHSD大鼠中，MOE主要影响PPP，这可能是对氧化应激的一种适应性反应，因为PPP激活会产生NADPH + H+，这是一种关键的抗氧化剂。NADPH + H+是谷胱甘肽还原酶的重要辅因子，负责将氧化型谷胱甘肽还原回其活性形式。谷胱甘肽已知可以保护神经元免受氧化应激，这表明可能通过抗氧化防御间接调节神经递质。
评估MOE对血浆和下丘脑代谢组的影响，可以整合系统和中枢代谢反应进行讨论。结果显示，补充MOE主要影响血浆中的胆汁酸代谢和下丘脑中的PPP。在文献中，胆汁酸受体，包括法尼醇X受体（FXR）和G蛋白偶联胆汁酸受体5（TGR5），在能量代谢中起关键作用。在大脑中，TGR5与肥胖和抑郁有关。虽然MOE尚未被证明能直接激活TGR5，但它调节高脂饮食大鼠的肠道微生物群。在本研究中，MOE降低了牛磺酸结合的胆汁酸，可能是通过微生物群介导的去结合作用，这可能会提高牛磺酸水平和非结合胆汁酸。在文献中，非结合胆汁酸可以穿过血脑屏障（BBB）并激活TGR5。有趣的是，TGR5激动剂给药可减少高脂饮食小鼠的肥胖标志物并调节能量平衡，而下丘脑TGR5激活可减轻饮食诱导的肥胖，其下调则会加剧肥胖。此外，最近的代谢组学研究表明，TGR5激动剂影响胆汁酸生物合成和PPP，这与我们的结果一致。除了抗肥胖和葡萄糖效应外，TGR5激动剂INT-777还能使大鼠的记忆缺陷和焦虑样行为正常化。此外，TGR5缺陷小鼠表现出焦虑和抑郁样行为。总之，我们的研究结果表明，MOE主要调节血浆中的胆汁酸代谢和下丘脑中的磷酸戊糖途径。结合现有文献，这些结果提示了一种复杂、多方面的MOE作用机制，其中胆汁酸信号传导和下丘脑能量代谢共同调节肥胖、葡萄糖代谢和焦虑样行为。
4. 材料与方法
本研究根据欧盟关于保护用于科学目的动物的指令2010/63/EU进行。所有程序均符合这些指南，并获得了Pays de la Loire CEEA06伦理委员会的批准。使用了24只雄性Wistar大鼠。动物被分为三组：维持标准块状饮食的对照组（SD）、高脂高糖饮食组（HFHSD）以及同时给予水醇标准化香蜂草提取物（HFHSD MOE）的HFHSD组。在12周的时间里，通过口服灌胃给予MOE，剂量为200 mg/kg。所有大鼠均可自由获取食物和水。在补充期结束时，评估每只大鼠的形态测量参数、高架十字迷宫（EPM）和口服葡萄糖耐量试验（OGTT）。每周监测大鼠体重。12周后还测量了体重指数（BMI）、肥胖指数（AI）和腹围（AC）。使用EPM测试评估大鼠行为。使用OGTT评估MOE对葡萄糖稳态的影响。在补充期结束时，对所有大鼠实施安乐死，收集血液、脑和内脏脂肪组织。通过血液离心分离血浆，并从脑中解剖下丘脑组织。使用非靶向代谢组学方法对血浆和下丘脑组织进行分析。使用超高效液相色谱（UHPLC）与四极杆飞行时间高分辨率质谱（QTOF-HRMS）联用进行分析。使用MassLynx软件进行数据采集。随后的数据处理，包括对齐、归一化、峰挑选和解卷积，使用Progenesis QI软件进行。为了阐明组间差异，对处理后的数据应用了正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）。通过R studio中使用Ropls包进行的置换测试验证了OPLS-DA结果的可靠性。应用变量重要性投影（VIP）> 1 且 p值 < 0.05来选择处理组之间显著不同的特征。使用集成在Progenesis QI中的人类代谢组数据库（HMDB）和北美MassBank（MoNA）进行鉴定。使用MetaboAnalyst 6.0进行富集途径研究。使用SMPDB进行富集分析。此外，通过MetaboAnalyst的大鼠KEGG途径模块进行途径分析。当p值 < 0.05时，认为途径具有统计学显著性。
5. 结论
基于之前一项调查MOE对行为和代谢组学影响的研究，本研究更深入地了解了其抗焦虑作用。虽然在高脂高糖饮食（HFHSD）喂养的大鼠中施用MOE并未导致体重、血糖或行为的统计学显著变化，但非靶向代谢组学揭示了几条代谢途径的调节，主要是胆汁酸和磷酸戊糖途径。这些代谢变化提示了MOE可能通过其后续作用机制对焦虑、肥胖和葡萄糖稳态发挥多靶点效应。重要的是，本文强调了非靶向代谢组学作为一种强大工具的价值，可以揭示可能被常规分析忽略的潜在机制和生物标志物。这些发现为未来的机制研究奠定了基础，并支持继续探索MOE作为一种具有多方面效应的有前景的植物性添加剂。虽然未实施随机化和盲法，但该研究为MOE的效果提供了有意义的初步见解。此外，尽管大鼠和狗之间存在生理差异，但大鼠在文献中被视为相关的实验模型，并已被用于研究犬类行为。然而，应该强调的是，使用肥胖大鼠模型存在局限性，因为它引入了代谢混杂因素，并且不能完全重现犬类状况。此外，在该模型中突出的代谢途径可能不能反映在目标物种（狗）中相同的生物学相关性。因此，本研究结果应被解释为探索性和假设生成性的，而非直接可转化。需要未来的研究来确认在狗身上是否观察到相同的机制，并评估这些发现在相关物种中的一致性。
