《International Journal of Molecular Sciences》：Plasma and Brain Metabolomics Uncover Modulation of Bile Acid and Pentose Phosphate Pathways by Melissa officinalis in Obese Rat Model
Fatima Zohra Aberkane,
Laura Natalia Ferro Holguín,
Anne-Sophie Roy,
Claire Maltret,
Sekhou Cisse,
Mohammed El Amine Benarbia,
Séverine Boisard,
Mohamed Yassine Mallem and
David Guilet
编辑推荐：
本文采用非靶向代谢组学技术，揭示了香蜂草提取物（MOE）在高脂高糖饮食（HFHSD）诱导的肥胖大鼠模型中对代谢途径的调控作用。研究发现，MOE虽未显著改善行为学焦虑指标，但显著降低了血糖曲线下面积（AUC），并特异性地调控了血浆中的胆汁酸生物合成通路和脑组织（下丘脑）中的戊糖磷酸（PPP）通路，为理解其潜在的抗焦虑、改善糖代谢及抗肥胖的多效性作用机制提供了新的见解。
引言
在宠物临床中，慢性应激是导致犬行为障碍的主要原因之一。在传统兽医学实践中，植物添加剂是用于帮助管理这类障碍的方法之一，其中香蜂草提取物在动物和人类中均被广泛记载具有镇静和抗焦虑作用。尽管其抗焦虑效果已被广泛证实，但其潜在的作用机制尚不完全明确。此前的研究多采用假设驱动的研究方法，例如探究其对乙酰胆碱受体或GABA（γ-aminobutyric acid）系统的调控。然而，宽谱探索性方法能够提供复杂系统的全局视角，从而识别出意料之外的生物标志物并为作用机制提供新见解。本研究团队此前在犬上的研究发现，香蜂草提取物具有抗焦虑效果，并且对犬血浆代谢组的分析突出了与胆汁酸生物合成相关的若干受影响通路。由于无法对犬进行脑组织采样，研究者通常依赖经过验证的啮齿类动物模型来检验从犬类研究中产生的机制假说。因此，本研究选用大鼠作为实验模型，以便获取脑组织进行分析。为了增加模型的敏感性，并因为代谢紊乱已知会增加对应激相关行为的易感性，本研究让一部分大鼠接受饮食诱导的肥胖方案。本研究旨在评估水醇法香蜂草提取物补充剂对肥胖大鼠的影响，重点关注下丘脑，以更深入地了解其抗焦虑作用的作用模式。
肥胖模型验证
研究首先验证了高脂高糖饮食诱导的肥胖模型。大鼠被饲喂HFHSD饮食12周。结果显示，与标准饮食组相比，HFHSD从第5周开始显著增加大鼠体重，并持续至第12周。HFHSD大鼠的最终体重较初始体重增加了29%。此外，HFHSD还导致大鼠的体重指数、肥胖指数和腹围显著增加。口服葡萄糖耐量试验显示，HFHSD大鼠的血糖水平在给予葡萄糖后15分钟内升高至约170 mg/dL，并在120分钟时仍稳定在较高水平。HFHSD大鼠的血糖曲线下面积也显著大于标准饮食组。这些发现共同证实，为期12周的HFHSD方案成功建立了一个稳健的肥胖模型，并伴有预期的代谢改变（即葡萄糖耐量受损），为后续研究MOE在此背景下的潜在有益效应提供了坚实基础。
MOE对体重的影响
在为期12周的实验期间，体重监测显示HFHSD组的体重从饮食第一周开始就显著增加，且在整个12周内持续显著高于标准饮食组。相比之下，虽然补充了MOE的HFHSD大鼠的体重似乎低于未补充的HFHSD大鼠，但这一差异无统计学显著性。
通过高架十字迷宫进行的行为学分析
接下来，研究通过高架十字迷宫测试评估了香蜂草提取物对HFHSD大鼠的抗焦虑效果。EPM测试基于大鼠在开臂和闭臂中停留的时间和行走的距离进行评估，在闭臂中停留更长时间表明更高的焦虑水平，而对开臂的探索则反映较低的焦虑水平。结果表明，HFHSD增加了在开臂的停留时间和距离，同时减少了在闭臂的相应指标，但这些差异无统计学显著性。同样，在HFHSD大鼠中补充MOE，与HFHSD组相比，在这些参数上也未产生统计学上的显著差异。
MOE对葡萄糖稳态的影响
口服葡萄糖耐量试验结果显示，与标准饮食组相比，HFHSD组从大约15分钟开始表现出更高的血糖水平，这种升高在随后的时间点持续存在。虽然补充MOE导致T0时间点的血糖水平降低，但在其他时间点未观察到显著差异。然而，AUC的测定显示，HFHSD大鼠的AUC显著高于标准饮食组大鼠，而补充MOE的HFHSD大鼠与单独HFHSD组相比，AUC显著降低。这表明MOE改变了整体血糖反应。
代谢组学分析
研究对血浆和脑（下丘脑）样本进行了非靶向代谢组学分析。提取方法在疏水提取物和亲水提取物中均显示出广泛的代谢物覆盖。首先通过正交偏最小二乘判别分析进行多变量分析，以识别组间差异。结果显示，饲喂HFHSD的大鼠与维持标准饮食的大鼠之间存在显著的代谢差异。通过比较HFHSD大鼠与补充MOE的HFHSD大鼠的代谢组，OPLS-DA模型显示两组在血浆和脑样本的HPO和HPI提取物上均存在差异，表明MOE补充影响了HFHSD大鼠的代谢组。
对代谢通路的影响
在血浆样本中，通过富集通路分析和基于京都基因与基因组百科全书通路的通路分析，深入了解了HFHSD饮食和MOE补充的影响。比较标准饮食组与HFHSD组发现，HFHSD显著影响了多个通路，其中最重要的是胆汁酸生物合成通路，有四个重叠代谢物。其他受影响的通路包括牛磺酸和亚牛磺酸代谢、鞘脂代谢以及甘油磷脂代谢。这些代谢物的表达谱在HFHSD大鼠与标准饮食组大鼠的比较中得到了具体分析，例如胆汁酸生物合成通路中的牛磺胆酸、牛磺酸和3a,7a,12a-三羟基-5b-胆甾烷-26-醛在HFHSD大鼠中表达上调，而甘氨胆酸表达下调。
在比较补充MOE的HFHSD组与单独HFHSD组时，分析揭示了MOE补充影响了不同的代谢通路。在血浆样本中，富集分析显示胆汁酸生物合成是一个显著受影响通路，有三个重叠代谢物。通路分析则显示甘油磷脂代谢和嘧啶代谢是显著受影响通路。具体而言，胆汁酸生物合成通路中的牛磺胆酸、石胆酰牛磺酸和牛磺去氧胆酸在MOE补充组中表达下调。甘油磷脂代谢相关的代谢物表达上调，而嘧啶代谢通路中的代谢物表达下调。
在脑样本分析中，比较HFHSD组与补充MOE的HFHSD组发现，MOE补充显著影响了多个与能量代谢相关的通路。富集分析显示，受影响最显著的通路是戊糖磷酸途径和淀粉与蔗糖代谢，各有三个重叠代谢物。此外，糖酵解、甘油酯代谢、果糖和甘露糖降解以及糖异生这四条相关通路也受到显著影响。通路分析同样突出了戊糖磷酸途径是受MOE补充影响的通路。这些通路中重叠代谢物的表达谱在补充MOE的HFHSD组中均呈现一致的上调。
讨论
植物提取物的一个主要优势在于其富含生物活性化合物，能够通过多种生化途径产生一系列生理效应。在本研究中，香蜂草提取物的效果在高脂高糖饮食大鼠模型中使用非靶向代谢组学方法进行了探索。该研究是此前一项研究香蜂草提取物对犬抗焦虑效果研究的后续。本研究选用大鼠模型允许获取脑样本，特别是下丘脑，以更好地理解香蜂草提取物抗焦虑作用的机制。高脂高糖饮食模型不仅用于研究MOE的抗焦虑效果，也用于研究其对肥胖和葡萄糖稳态的影响。非靶向代谢组学作为一种探索性方法，旨在阐明MOE在高脂高糖饮食大鼠模型中诱导的代谢变化，以更好地理解MOE的作用机制，主要涉及焦虑、肥胖和葡萄糖稳态。
本研究中使用的HFHSD模型成功诱导了大鼠肥胖。MOE对HFHSD大鼠的体重有轻微影响，但变化无统计学显著性。尽管多项研究报告了补充香蜂草提取物后体重显著降低，但这些研究采用了与本研究所用Wistar大鼠模型不同的实验动物模型，例如小鼠模型或OLETF大鼠。不同物种的能量代谢差异、遗传背景以及提取物剂量和成分的差异，可能解释了观察到的结果差异性。
香蜂草提取物的抗焦虑作用已被广泛记载。本研究使用高架十字迷宫测试评估了水醇法MOE在HFHSD大鼠中的抗焦虑效果。结果表明MOE并未改善HFHSD大鼠的焦虑。这与最近一项比较香蜂草水提取物和醇提取物效果的研究结果部分一致，该研究显示醇提取物在C57BL/6小鼠模型中未能减少焦虑。提取溶剂和提取物成分的差异可能导致所报告的抗焦虑效果的差异性。此外，本研究中选用的MOE剂量是基于先前在犬模型中证明有效的剂量探索性确定的，未进行基于种间换算的剂量调整，这可能是未观察到抗焦虑效果的原因之一。
香蜂草提取物也已知具有调节血糖水平的作用。本研究中，OGTT结果显示补充MOE的HFHSD大鼠血糖水平有所降低，尽管在除T0外的单个时间点不显著，但AUC显示与HFHSD对照组相比有显著整体下降。这表明MOE改变了整体血糖反应。血糖测量的AUC被认为是评估葡萄糖耐量更可靠和敏感的指标。
非靶向代谢组学分析表明，HFHSD饮食影响了大鼠的多个通路，主要是胆汁酸合成以及牛磺酸和亚牛磺酸代谢，这与肥胖期间作为膳食脂肪吸收乳化剂的胆汁酸作用增加相符。HFHSD还影响了脂质代谢，特别是鞘脂和甘油磷脂代谢。补充MOE后，血浆样本分析显示胆汁酸生物合成、甘油磷脂和嘧啶代谢受到影响。观察到补充MOE后结合胆汁酸减少，这可能有助于其抗肥胖效应。结合胆汁酸影响肥胖、能量代谢和葡萄糖调节，并与焦虑相关。MOE的抗焦虑作用可能涉及其对结合胆汁酸的调节。
在脑组织，特别是下丘脑，MOE的补充主要影响了与戊糖磷酸途径和能量代谢相关的通路。补充MOE的HFHSD大鼠血糖水平降低，表明胰岛素敏感性改善和细胞葡萄糖摄取增强。在脑中，葡萄糖是主要能量来源。葡萄糖耐量的改善可能因此改善包括下丘脑在内的脑葡萄糖摄取。然而，在HFHSD大鼠中，MOE主要影响了PPP，这可能是对氧化应激的一种适应性反应，因为PPP的激活会产生关键的抗氧化剂NADPH + H+。NADPH + H+是谷胱甘肽还原酶的重要辅助因子，而谷胱甘肽已知可保护神经元免受氧化应激，这表明可能通过抗氧化防御间接调节神经递质。这些发现突出了PPP在葡萄糖稳态、肥胖和心理障碍中的作用。
综合评估MOE对血浆和下丘脑代谢组的影响，可以整合系统性和中枢性代谢反应进行讨论。结果显示，补充MOE主要影响了血浆中的胆汁酸代谢和下丘脑中的PPP。文献表明，胆汁酸受体，包括法尼醇X受体和G蛋白偶联胆汁酸受体5，在能量代谢中起关键作用。在大脑中，TGR5与肥胖和抑郁有关。虽然MOE尚未被证明能直接激活TGR5，但它调节高脂饮食大鼠的肠道微生物群。在本研究中，MOE降低了牛磺酸结合型胆汁酸，可能是通过微生物群介导的去结合作用，这可能会提高牛磺酸水平和非结合型胆汁酸。非结合型胆汁酸可以穿过血脑屏障并激活TGR5。TGR5激动剂给药可减少肥胖标志物并调节能量平衡，而下丘脑TGR5激活可减轻饮食诱导的肥胖，其下调会加剧肥胖。此外，最近的代谢组学研究显示TGR5激动剂影响胆汁酸生物合成和PPP，这与本研究结果一致。除了抗肥胖和降糖作用外，TGR5激动剂还能使大鼠的记忆缺陷和焦虑样行为正常化。综合来看，本研究结果表明，MOE主要调节血浆中的胆汁酸代谢和下丘脑中的戊糖磷酸途径。结合现有文献，这些结果提示了MOE一种复杂、多方面的作用机制，其中胆汁酸信号和下丘脑能量代谢共同调节肥胖、葡萄糖代谢和焦虑样行为。
材料与方法
本研究依照欧盟关于保护用于科学目的的动物的指令2010/63/EU进行。所有程序均符合相关指南，并获得了Pays de la Loire CEEA06伦理委员会的批准。研究使用了24只6周龄雄性Wistar大鼠，适应标准实验室条件两周后，分为三组：标准饲料对照组、高脂高糖饮食组、以及高脂高糖饮食并同时给予水醇法标准化香蜂草提取物组。MOE通过口服灌胃给药，剂量为200 mg/kg，持续12周。所有大鼠自由获取食物和水。在补充期结束后，评估了大鼠的形态测量参数、高架十字迷宫行为和口服葡萄糖耐量。
体重和形态测量每周监测一次。在12周时测量了体重指数、肥胖指数和腹围。通过收集内脏脂肪组织并称重计算肥胖指数。使用高架十字迷宫评估大鼠行为，记录在开臂和闭臂的停留时间和行走距离。口服葡萄糖耐量试验在12周补充后进行，大鼠禁食4小时后灌胃给予葡萄糖溶液，并在不同时间点采集尾静脉血测量血糖水平。
补充期结束时，所有大鼠经麻醉后通过腹主动脉放血处死，收集血液和器官。通过离心分离血浆，并从大脑中解剖出下丘脑组织用于代谢组学分析。
代谢物从血浆和下丘脑样本中提取，采用了基于Zhang等人2019年方法的改良方案，分别获得疏水提取物和亲水提取物。使用超高效液相色谱串联四极杆飞行时间高分辨质谱进行分析。色谱分离采用HSS T3色谱柱，流动相为含0.1%甲酸的水和含0.1%甲酸的乙腈。质谱分析在负离子模式下进行。使用MassLynx软件进行数据采集，随后使用Progenesis QI软件进行包括对齐、归一化、峰提取和解卷积在内的数据处理。通过正交偏最小二乘判别分析阐明组间差异，并通过置换检验验证OPLS-DA结果的可靠性。应用变量重要性投影值大于1且p值小于0.05的标准选择处理组间显著差异的特征。使用整合在Progenesis QI中的人类代谢组数据库和MassBank of North America进行代谢物鉴定。通过MetaboAnalyst 6.0进行富集通路分析和基于京都基因与基因组百科全书通路的通路分析。p值小于0.05的通路被认为具有统计学显著性。
结论
基于先前一项研究MOE对行为和代谢组学影响的研究，本研究更深入地探讨了其抗焦虑作用。虽然在高脂高糖饮食喂养的大鼠中给予MOE并未导致体重、血糖或行为的统计学显著变化，但非靶向代谢组学揭示了几条代谢通路的调控，主要是胆汁酸和戊糖磷酸途径。这些代谢变化提示了MOE可能通过此后续作用机制，发挥其对焦虑、肥胖和葡萄糖稳态的多靶点效应。重要的是，本文强调了非靶向代谢组学作为一种强大工具的价值，能够发现被常规分析忽略的潜在机制和生物标志物。这些发现为未来的机制研究奠定了基础，并支持继续探索MOE作为一种具有多方面效应的、有前景的植物基添加剂。虽然本研究未实施随机化和盲法，但它为MOE的效应提供了有意义的初步见解。此外，尽管大鼠与犬之间存在生理差异，但文献中将大鼠视为相关的实验模型，并已用于研究犬类行为。需要强调的是，使用肥胖大鼠模型存在局限性，因为它引入了代谢混杂因素，并且不能完全复现犬的状况。在此模型中突出的代谢通路可能无法反映在目标物种犬中相同的生物学相关性。因此，本研究结果应被视为探索性和假设生成性的，而非可直接转化的。未来需要进一步研究来确认在犬中是否观察到相同的机制，并评估这些发现在目标物种中的一致性。
