《International Journal of Molecular Sciences》：Three-Dimensional Culture of Primary Hepatocytes in a Single-Cell Layer on Poly(vinyl alcohol) Nanofibrous Membrane
Hue Vy An Tran,
Song-Hee Han,
Thi Xuan Thuy Tran,
Kwan Woo Kim,
Min Chan Kim,
In-Jeong Lee and
Jong-Young Kwak
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本文创新性地利用聚（乙烯醇）（PVA）纳米纤维膜（NM），成功构建了一种支持原代肝细胞长期功能的三维（3D）单细胞层培养体系。通过将肝细胞在经NaOH处理的RGD-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽修饰的PVA（RGD-PVA）NM上进行培养，并结合聚己内酯（PCL）NM层中的NIH3T3成纤维细胞进行间接共培养，该模型能有效维持肝细胞的稳定形态、白蛋白分泌及细胞色素P450 3A4（CYP3A4）活性，为药物发现、毒性测试及肝脏转化研究提供了优越的体外平台。
引言
原代肝细胞是研究药物清除、代谢物形成及肝脏疾病机制的理想体外模型。然而，在传统的二维（2D）培养条件下，原代肝细胞会迅速失去其特有的立方体形态和功能特性，发生去分化。三维（3D）培养体系，包括微流控平台、水凝胶和聚合物支架等，被开发出来以更好地模拟体内微环境。纳米纤维支架因其三维纤维多孔结构类似天然细胞外基质（ECM）而被广泛应用。本研究旨在利用聚（乙烯醇）（PVA）纳米纤维膜（NM）建立一种支持原代肝细胞长期功能的三维培养系统。
结果
1. PVA与PCL纳米纤维膜的制备与表征
通过静电纺丝技术制备了PVA和聚己内酯（PCL）纳米纤维膜。扫描电子显微镜（SEM）分析显示，PVA NM的纤维直径均匀（平均205.1±20.5纳米），孔隙较小；而PCL NM的纤维直径范围较宽（400纳米至5微米），孔隙较大。PVA NM的光学透明性便于直接观察细胞。PCL NM的大孔隙结构利于成纤维细胞（NIH3T3）浸润并在其中三维生长。
2. 原代肝细胞在PVA NM上的单培养及与成纤维细胞的间接共培养
将原代肝细胞单独培养在PVA NM上，或与培养在下层PCL NM中的NIH3T3成纤维细胞进行间接共培养（层叠共培养系统）。约80%的肝细胞在接种后24小时内粘附到PVA NM表面。培养至第3天，肝细胞开始形成多细胞聚集体。在共培养条件下，细胞从第1天起就倾向于形成聚集体，且聚集体尺寸随培养时间增加而增大。活/死细胞染色显示，培养7天后，单培养和共培养条件下的细胞存活率相当。SEM图像显示，肝细胞以圆形细胞形式粘附在完整的PVA纳米纤维上，并在膜表面形成大小不一的多细胞聚集体，未观察到细胞浸润到膜内。共培养条件下形成的聚集体随时间推移变得更为致密。
3. 原代肝细胞在RGD修饰的PVA NM上的培养
为了增强细胞-材料相互作用，研究人员制备了掺有整合素结合肽（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸，RGD）的PVA NM（RGD-PVA NM）。与对照PVA NM相比，RGD-PVA NM的纤维结构和直径相似，孔隙率和亲水性无显著差异。研究发现，RGD-PVA NM不释放松散结合的肽，且经1M NaOH处理后肽得以保留。将肝细胞培养在经NaOH处理或未处理的PVA NM和RGD-PVA NM上14天，结果发现：
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在未经处理的RGD-PVA NM上，肝细胞聚集随时间增加。
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在经NaOH处理的PVA NM上，细胞聚集体形成减少。
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在经NaOH处理的RGD-PVA NM上培养14天的肝细胞均匀分布，未形成大的细胞聚集体，呈单细胞层状态。SEM图像显示这些细胞分散，具有规则的尺寸和形态。
免疫荧光染色显示，培养在经NaOH处理的RGD-PVA NM上的肝细胞呈特征性圆形形态，白蛋白和E-钙粘蛋白表达得以维持，细胞均匀稀疏地分布在膜上。对培养上清液的分析表明，从培养第1天起就有白蛋白分泌，并持续增加至第14天。在培养7天后，经NaOH处理的PVA和RGD-PVA NM上的肝细胞白蛋白分泌量高于未经处理的PVA NM。
4. 骨髓来源树突状细胞在经处理与未经处理PVA NM上的培养（生物惰性评估）
评估膜的生物惰性对于避免非特异性细胞反应至关重要。通过测量未受刺激的骨髓来源树突状细胞（BM-DC）的活化来评估。结果显示，在未经处理的PVA NM上培养的未受刺激BM-DC，其活化标志物CD86的表达和肿瘤坏死因子α（TNF-α）的分泌显著增加。相比之下，在经NaOH处理的PVA或RGD-PVA NM上，BM-DC的CD86表达水平和TNF-α分泌均未增加，表明经NaOH处理的膜具有生物惰性。
5. 原代肝细胞在PVA和RGD-PVA NM上与NIH3T3细胞的长期间接共培养
在后续所有共培养实验中，均使用经NaOH处理的PVA和RGD-PVA NM。将原代肝细胞在PVA和RGD-PVA NM上单独培养或与NIH3T3细胞间接共培养14天。结果显示，与单培养相比，与NIH3T3细胞的共培养改善了细胞在PVA和RGD-PVA NM上的粘附和分布，细胞形态更均匀。白蛋白分泌测定表明，在PVA和RGD-PVA NM上，与成纤维细胞共培养能显著增加原代肝细胞的白蛋白分泌。特别是在共培养条件下，RGD-PVA NM上的细胞白蛋白分泌量远高于PVA NM上的细胞。
6. 药物代谢能力评估
以苯妥英为模型药物，评估不同培养条件下细胞的药物代谢能力。细胞计数试剂盒-8（CCK-8）检测显示，在PVA和RGD-PVA NM上培养的原代肝细胞活力相似，且共培养维持了更高的细胞数量。苯妥英处理不影响任何条件下的细胞活力。细胞色素P450 3A4（CYP3A4）活性检测显示：
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基础CYP3A4活性：在RGD-PVA NM上与成纤维细胞共培养的肝细胞中最高。
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苯妥英诱导的CYP3A4活性：在RGD-PVA NM上的细胞中显著高于PVA NM，且与NIH3T3细胞共培养进一步增强了此效应。
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培养7天后，尽管肝细胞的CYP3A4活性相比新鲜分离的细胞有所下降，但在RGD-PVA NM上与NIH3T3细胞共培养的肝细胞中活性仍为最高。
此外，用强效CYP3A诱导剂孕烯醇酮16α-甲腈（PCN）处理细胞，PCN诱导的CYP3A4活性同样在RGD-PVA NM上与NIH3T3细胞共培养的肝细胞中最高，且可维持升高状态达14天。
7. 原代肝细胞与肝癌细胞在PVA和RGD-PVA NM上的直接共培养
将荧光标记的原代肝细胞和小鼠肝癌细胞（Hepa-1c1c7）按1:1比例混合，接种到PVA和RGD-PVA NM上，并与下层NIH3T3细胞间接共培养7天。两种细胞均能存活。在PVA NM上，Hepa-1c1c7细胞与原代肝细胞形成明显的簇；而在RGD-PVA NM上，两种细胞的成簇现象减少，铺展形态更明显。
讨论
本研究成功在RGD-PVA NM上实现了功能化肝细胞的三维单细胞层长期培养。PVA NM的物理特性（均匀的纳米纤维直径和孔隙）使其适合三维细胞培养，但缺乏细胞结合基序。NaOH处理不仅稳定了PVA纳米纤维，增强了细胞粘附，还去除了可能刺激免疫反应的物质，使膜具有生物惰性。RGD肽的引入模拟了纤维连接蛋白的细胞结合域，增强了肝细胞对纳米纤维的粘附，减少了细胞间聚集，从而形成单细胞层。成纤维细胞通过提供可溶性因子和合成ECM蛋白，在间接共培养系统中对维持肝细胞功能起到了关键的辅助支持作用。与传统的2D培养或3D球体培养相比，这种在RGD-PVA NM上的三维单细胞层培养能更好地模拟体内肝细胞的极性和排列（肝板），并长期维持白蛋白分泌和CYP3A4代谢活性。该培养方法操作简便，为药物发现、毒性测试、肝脏疾病建模及转化研究提供了一个稳定、可靠且更具生理相关性的体外平台。
材料与方法
研究详细描述了PVA和PCL纳米纤维的静电纺丝制备工艺、原代小鼠肝细胞的两步胶原酶灌注分离法、NIH3T3成纤维细胞和Hepa-1c1c7肝癌细胞的培养、骨髓来源树突状细胞的制备与培养、层叠共培养系统的组装、扫描电镜和激光共聚焦显微镜的样品制备与观察、细胞活力（CCK-8法）和活/死细胞染色、白蛋白分泌的酶联免疫吸附试验（ELISA）检测、CYP3A4活性（P450-Glo?试剂盒）测定以及相关的统计学分析方法。
结论
RGD肽修饰的纳米纤维有效模拟了天然肝脏ECM，增强了肝细胞粘附。与成纤维细胞在PCL NM上层叠间接共培养的系统，能长期维持肝细胞的三维单细胞层结构、稳定形态及肝脏特异性功能（如白蛋白分泌和CYP3A4活性）。该方法克服了传统二维培养的局限性，为药物代谢、肝毒性研究及肝脏组织工程提供了一个有前景的、可重复的三维细胞模型。预计肝细胞的这种长期培养将有助于进一步的药物发现和毒性研究。
