编辑推荐：
肌萎缩侧索硬化症（ALS）是一种致命的神经退行性疾病，目前缺乏有效疗法。本研究针对一种由TARDBP基因c.1127G>A突变（导致TDP-43蛋白G376D替换）引起的家族性ALS，设计了一种特异性靶向该突变等位基因的小干扰RNA（siRNA，称为m10）。研究表明，在诱导多能干细胞（iPSC）来源的运动神经元中，m10治疗能够有效减少TDP-43的胞质错误定位和聚集，改善溶酶体功能，降低氧化应激，并提高细胞活力。这为携带TDP-43G376D突变的ALS患者提供了一种有前景的、精准的基因治疗策略。
引言
肌萎缩侧索硬化症（Amyotrophic lateral sclerosis, ALS）是一种致命的神经退行性疾病，主要影响运动皮层、脑干和脊髓中的上下运动神经元。其症状包括肌肉无力、吞咽困难、构音障碍、痉挛和瘫痪，患者在症状出现后的平均预期寿命仅为2-5年。大多数ALS病例是散发性的（约90%），而约10%为家族性，通常以常染色体显性方式遗传。在家族性ALS中，TARDBP基因突变约占3-5%，该基因编码TDP-43蛋白。TDP-43是一种主要位于细胞核的蛋白，参与RNA代谢的多个方面。在ALS中，TDP-43突变会导致其错误定位到细胞质中，形成不溶性、泛素化的聚集体，这是ALS的主要病理标志之一。这种异常定位会引发细胞稳态失衡，包括自噬改变、应激颗粒形成增加和线粒体功能障碍，最终导致神经元死亡。
其中，TARDBP基因第6外显子的c.1127G>A杂合错义突变会导致TDP-43蛋白第376位的甘氨酸被天冬氨酸取代（p.G376D）。该突变与TDP-43错误定位、胞质内包含体形成、溶酶体和线粒体功能障碍以及氧化应激增加相关。目前针对ALS的药物治疗（如利鲁唑、依达拉奉、苯丁酸钠/牛磺熊去氧胆酸联合疗法）仅能有限地延缓疾病进展。因此，开发新的治疗策略迫在眉睫。基于基因沉默的疗法，如针对SOD1相关ALS的反义寡核苷酸Tofersen，显示出一定前景。然而，由于TDP-43蛋白水平需要被精确调控，既不能过多也不能过少，因此针对TDP-43的基因疗法更具挑战性。本研究团队此前设计了一种名为m10的小干扰RNA（siRNA），它特异性互补于包含c.1127G>A点突变的区域，能够选择性地沉默编码TDP-43G376D的突变等位基因，而不影响野生型等位基因，并在患者来源的成纤维细胞中证明其可减少TDP-43聚集、降低氧化应激并提高细胞活力。本研究旨在评估m10在由诱导多能干细胞（iPSC）分化的、携带TDP-43G376D突变的运动神经元中纠正疾病相关表型的效力。
材料与方法
本研究使用了来自一名健康对照和一名携带p.G376D TDP-43突变的ALS患者在疾病诊断时（ALS1O）及四年后（ALS1A）的皮肤成纤维细胞重编程得到的三株iPSC系。这些细胞系通过piggyBac转座子系统稳定整合了与运动神经元分化相关的基因，并在基质胶上培养分化成运动神经元。在分化第12天，使用Neuromag转染试剂将运动神经元分别用对照RNA、靶向TDP-43 mRNA 5'区域的siRNA（TDPi）或m10 siRNA进行处理。siRNA处理后6天，对细胞进行分析。
采用的方法包括：实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）分析TDP-43等基因的mRNA水平；共聚焦显微镜观察TDP-43的定位和溶酶体功能（使用LysoTracker Red DND-99染色）；H2DCFDA染色检测细胞内活性氧（ROS）水平；磺酰罗丹明B（Sulforhodamine B, SRB）测定法检测细胞活力；蛋白质印迹法（Western Blot）检测胆碱乙酰转移酶（ChAT）等蛋白表达。使用ImageJ软件对荧光强度进行定量分析，数据统计分析采用Student's t检验或单因素方差分析（one-way ANOVA）及Dunnett多重比较检验。
结果
等位基因特异性沉默减少ALS运动神经元中的TDP-43错误定位
TDP-43的ALS相关突变会导致该蛋白错误定位并在胞质中积累。实时荧光定量PCR分析证实，m10能够特异性下调突变型TDP-43 mRNA，而不影响野生型mRNA。在iPSC分化的运动神经元中，ALS1A细胞表现出明显的TDP-43胞质错误定位，而对照细胞和ALS1O细胞中此现象不明显。用m10处理后，ALS1A运动神经元中的胞质TDP-43错误定位显著减少，使其表型与ALS1O细胞相似。这表明m10能够对抗ALS的主要病理标志，显著减少TDP-43的错误定位和胞质聚集。
等位基因特异性沉默改善ALS运动神经元的溶酶体功能
TDP-43G376D与溶酶体功能障碍相关。此前研究已表明，携带此突变的ALS细胞溶酶体降解活性和酸化作用降低。本研究通过LysoTracker Red染色评估溶酶体酸性，发现与对照细胞相比，ALS1O和ALS1A细胞的LysoTracker荧光强度均降低。而经m10处理后，细胞的LysoTracker荧光强度恢复到与对照细胞相似的水平。这表明ALS运动神经元存在溶酶体酸化功能受损，而m10治疗能改善溶酶体功能，逆转这一病理表型。同时，神经元微管蛋白标记物Tuj1在对照运动神经元中组织得更好，在m10处理后，Tuj1在神经元突起中显示出更连续和有组织的模式，提示细胞骨架结构和神经突稳定性的部分恢复。
等位基因特异性沉默降低氧化应激并提高细胞活力
TDP-43G376D与线粒体功能障碍和氧化应激增加有关。H2DCFDA检测显示，与对照细胞相比，ALS运动神经元的ROS水平更高，而m10处理能显著降低ROS的产生。同时，ALS运动神经元的细胞活力低于对照细胞，m10处理能显著提高其细胞活力，这种效应在ALS1O细胞中尤为明显，提示早期干预可能带来更有利的结果。
在基因表达层面，ALS运动神经元基础状态下线粒体超氧化物歧化酶SOD2的mRNA水平降低，而胞质SOD1表达未受影响。m10处理能够恢复ALS运动神经元中SOD2的mRNA水平。此外，ALS运动神经元中过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1β（PGC-1β）的基础表达也降低，而PGC-1α、核呼吸因子1（NRF1）和线粒体转录因子A（TFAM）的mRNA水平未见显著变化。m10处理同样能够恢复PGC-1β的表达。这些发现表明，在ALS运动神经元中存在线粒体抗氧化防御系统和PGC-1β依赖的线粒体调节通路的特异性改变，而突变等位基因特异性沉默可以部分纠正这些改变。
讨论
本研究证明，通过siRNA（m10）实现的突变TDP-43G376D等位基因特异性沉默，能够纠正ALS的多个病理表型。m10能够特异性降低突变型TDP-43 mRNA，减少其在iPSC来源运动神经元中的胞质错误定位，并改善溶酶体功能、降低氧化应激、提高细胞活力。值得注意的是，m10的治疗效果在ALS1O（早期疾病阶段样本）运动神经元中比在ALS1A（晚期疾病阶段样本）中更显著，这表明早期干预可能产生更佳的临床效益，这与针对SOD1突变的基因疗法Tofersen的临床经验相似。
一个关键点是m10能选择性靶向突变等位基因，不影响野生型。治疗后，总的TDP-43蛋白水平保持不变，这与TDP-43表达的自我调节机制一致。因此，m10选择性地减少了易于聚集的突变蛋白，同时保持了整体的TDP-43稳态。目前用于治疗ALS的药物主要针对氧化应激和兴奋性毒性，而m10的作用机制还能改善溶酶体功能，这为患者带来了更大的潜在获益。
当然，本研究也存在局限性。数据来源于体外模型，需要在活体生物中验证siRNA的效力。主要的挑战在于体内递送，如何实现安全、稳定、高效地将siRNA递送至运动神经元是一个复杂任务。病毒载体（如腺相关病毒，AAV）和脂质纳米颗粒等平台可能是潜在的解决方案。此外，还需评估治疗效果的持续时间和是否需要重复给药。未来的研究也将侧重于评估m10在逆转TDP-43G376D突变相关的其他细胞功能障碍（如线粒体功能障碍）方面的有效性。
结论
综上所述，我们的研究结果支持等位基因特异性siRNA沉默是治疗由TDP-43G376D突变引起的ALS的一种创新且有前景的方法。在iPSC分化的运动神经元中，siRNA治疗可以逆转TDP-43错误定位、溶酶体功能障碍和氧化应激等ALS相关病理表型。早期治疗对于获得更好的患者预后似乎至关重要，这也凸显了寻找用于早期诊断的生物标志物的必要性。如果得到进一步的临床前和临床研究证实，siRNA治疗可能为基于选择性纠正致病基因突变的ALS个性化疗法铺平道路。
