《Biomolecules》：Glycogen Hydrogel Loaded with Schistosoma japonicas Peptide SJMHE1 Improves Skin Wound Healing
Yanwei Yang,
Shang Wang,
Yuyun Jiang,
Liyue Huo,
Wei Zhu,
Xiaolin Zhang,
Yubei Zhang and
Xuefeng Wang
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本研究报道了一种负载日本血吸虫来源的免疫调节肽SJMHE1的糖原水凝胶（SJMHE1-gel）用于促进皮肤创伤修复。该水凝胶制备简易、生物相容性优异，可缓释药物。在小鼠全层皮肤缺损模型中，SJMHE1-gel可显著加速伤口愈合，其机制在于：1）调控巨噬细胞向M2表型极化，抑制炎症因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）并促进抗炎因子（IL-10）表达；2）通过上调TGF-β1激活TGF-β1/Smad3通路，促进成纤维细胞（L929）和人脐静脉内皮细胞（HUVECs）迁移及胶原蛋白I（COL1a1）沉积；3）通过上调血管内皮生长因子A（VEGFA）表达，促进血管生成。该研究为开发多功能创伤敷料提供了新思路。
当前，皮肤创伤修复策略面临诸多挑战，尤其随着人口老龄化，与衰老、糖尿病等相关的难愈性伤口构成了重大的公共卫生负担。传统治疗方法在应对复杂、慢性伤口方面仍有不足。寄生蠕虫在长期与宿主共进化中，发展出调控宿主免疫并促进组织修复的机制，这为开发新型治疗药物提供了灵感。其中，来自日本血吸虫（Schistosoma japonicum）的免疫调节肽SJMHE1，已被证明在多种炎症性疾病和神经损伤修复中具有治疗潜力，但其作为肽类药物存在稳定性差、易被蛋白酶降解的问题。
为解决上述问题，本研究利用一种天然生物材料——糖原（glycogen）来封装SJMHE1肽，并成功开发了一种制备简便的水凝胶制剂，命名为SJMHE1-gel。该水凝胶具有均匀的孔径、优异的生物相容性，并能实现SJMHE1的持续释放，在48小时内累计释放率可达约85%。
SJMHE1-gel的表征与生物相容性
扫描电子显微镜（SEM）图像显示，SJMHE1-gel具有相互连通的均匀多孔网状结构，这种结构有利于药物负载。力学测试表明其最大压缩应力约为0.5 MPa，展现出良好的弹性。细胞毒性实验（CCK-8法）证明，水凝胶提取物对小鼠成纤维细胞（L929）的增殖无抑制作用。体外溶血实验也证实，无论是空白水凝胶还是SJMHE1-gel，其溶血率均低于5%，表现出优异的血液相容性。
SJMHE1-gel促进小鼠皮肤创伤愈合
为了评估SJMHE1-gel的体内疗效，研究者在C57BL/6小鼠背部建立了直径8毫米的全层皮肤缺损模型。实验设置模型组（无处理）、空白凝胶组、SJMHE1-gel组和胶原酶软膏组（阳性对照）。通过定期拍照并利用ImageJ软件分析伤口面积发现，SJMHE1-gel治疗显著加速了伤口愈合。在创伤后第3天，SJMHE1-gel组的愈合面积已达63.7 ± 6.9%，显著高于其他各组。到第11天，SJMHE1-gel组和胶原酶组的伤口已接近完全愈合，而模型组和空白凝胶组仍有部分结痂，愈合不完全。这些结果表明，SJMHE1-gel在创伤早期阶段的促愈合效果甚至优于阳性对照药物胶原酶。
SJMHE1-gel减轻炎症并促进伤口组织重建
组织学分析进一步揭示了SJMHE1-gel的治疗效果。苏木精-伊红（H&E）染色显示，在创伤后第11天，SJMHE1-gel治疗组实现了完全的上皮再生。与模型组相比，SJMHE1-gel组伤口处的炎症细胞浸润显著减少，伤口长度更短，新生表皮厚度也更接近正常皮肤。Masson三色染色显示，SJMHE1-gel组的胶原纤维排列更致密、更有序。免疫组织化学和定量实时聚合酶链式反应（qRT-PCR）结果均证实，SJMHE1-gel组伤口组织中I型胶原（COL1a1）的蛋白和mRNA表达水平均显著上调。这些结果说明，SJMHE1-gel治疗有效减轻了炎症，加速了上皮再生，并促进了胶原的合成与沉积，从而改善了愈合伤口的组织结构。
SJMHE1-gel在创伤早期促进血管生成
新生血管形成是创伤愈合增殖期的关键步骤，为伤口提供营养和氧气。通过CD31（血管内皮细胞标志物）免疫组化染色评估血管生成情况。在创伤后第7天，SJMHE1-gel组伤口处的CD31阳性微血管数量显著高于模型组。有趣的是，到第11天，SJMHE1-gel组的微血管密度相较于第7天显著下降，而其他组则呈现上升趋势。这表明SJMHE1-gel治疗加速了伤口愈合从增殖期间重塑期的过渡，促进了血管的正常化。
SJMHE1-gel促进M2巨噬细胞极化并抑制炎症反应
巨噬细胞在创伤愈合过程中扮演着核心角色。通过免疫荧光染色发现，用异硫氰酸荧光素（FITC）标记的SJMHE1肽在伤口组织中与巨噬细胞标志物F4/80存在共定位，表明SJMHE1-gel能被伤口处的巨噬细胞摄取。进一步分析显示，在创伤后第7天，SJMHE1-gel组伤口组织中促炎型M1巨噬细胞标志物诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的表达降低，而修复型M2巨噬细胞标志物精氨酸酶-1（Arg1）的表达升高。与之对应，qPCR分析表明，SJMHE1-gel组伤口组织中促炎细胞因子白细胞介素-1β（IL-1β）、IL-6、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的mRNA表达下调，而抗炎细胞因子IL-10的mRNA表达上调。这些结果说明，SJMHE1-gel通过促进巨噬细胞向M2表型极化来抑制伤口炎症。
体外实验验证了上述发现。用脂多糖（LPS）刺激小鼠巨噬细胞系RAW264.7诱导炎症，并用SJMHE1进行预处理。结果显示，SJMHE1预处理显著上调了Arg1蛋白表达和M2标志物CD206+细胞的比例，同时抑制了LPS诱导的IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表达，并促进了IL-10的mRNA表达。这证实SJMHE1在体外同样具有促进M2巨噬细胞极化和抑制炎症因子表达的作用。
SJMHE1处理的巨噬细胞通过TGF-β1/Smad3通路和VEGFA上调促进细胞迁移与血管形成
M2巨噬细胞分泌的生长因子，如转化生长因子-β1（TGF-β1）和血管内皮生长因子A（VEGFA），是推动创伤愈合进入增殖期的关键。机制研究发现，SJMHE1处理的巨噬细胞中TGF-β1的表达显著上调。这些巨噬细胞的条件培养基（CM-SJMHE1）能够激活L929成纤维细胞和人脐静脉内皮细胞（HUVECs）中的TGF-β1/Smad3信号通路，表现为磷酸化Smad3（p-Smad3）水平升高。划痕实验表明，CM-SJMHE1能显著促进L929细胞和HUVECs的迁移，而这种促迁移作用可被TGF-β1中和抗体所减弱。此外，CM-SJMHE1还能刺激L929细胞高表达COL1a1 mRNA。
同时，SJMHE1处理的巨噬细胞也上调了VEGFA的表达。CM-SJMHE1在体外能诱导HUVECs形成更密集、分支更多的管状网络结构，总管长显著增加。这表明SJMHE1通过上调VEGFA促进了血管生成。
SJMHE1-gel在体内激活TGF-β1/Smad3通路并上调VEGFA
体内实验与体外结果相互印证。对小鼠创伤后第7天的伤口组织进行免疫组化分析发现，SJMHE1-gel治疗组中TGF-β1、p-Smad3和VEGFA的表达均显著高于对照组。尤其值得注意的是，p-Smad3在SJMHE1-gel组中表现出核富集现象，明确提示TGF-β1/Smad3信号通路在伤口组织中被激活。
综上所述，本研究成功开发了一种新型、简易的SJMHE1-糖原复合水凝胶。该水凝胶通过诱导巨噬细胞向M2表型极化，抑制炎症反应，并同时上调TGF-β1和VEGFA的表达，进而激活TGF-β1/Smad3通路，促进成纤维细胞和内皮细胞的迁移、胶原沉积及血管生成，从而跨越炎症、增殖和重塑多个阶段，全方位加速急性皮肤创伤的愈合。这种成本低廉、制备简单、安全性高的水凝胶在皮肤创伤修复领域展现出巨大的应用潜力。
