《Biomolecules》：Extracellular Vesicles Derived from Human CD24+ Dental Papilla Stem Cells Promote Vascularized Dental Pulp Regeneration
Jie Li,
Tian Chen,
Cheng Liang,
Peini Lin,
Weidong Tian,
Zhi Liu and
Lei Liu
编辑推荐：
牙髓坏死是临床重大挑战，现有疗法难以实现功能性牙髓再生。本文聚焦具有卓越再生潜能的功能性细胞亚群——CD24+人牙乳头细胞(CD24+hDPCs)，并评估其来源的细胞外囊泡(CD24+EVs)在牙髓样组织再生中的作用。研究发现，CD24+EVs可协同增强人牙髓干细胞(hDPSCs)的迁移、成牙/成骨分化及血管生成，在体内诱导形成结构良好、高度血管化的牙髓样组织。该研究为基于功能性细胞亚群的细胞辅助EV策略用于牙髓再生提供了新思路。
CD24+人牙乳头干细胞及其外泌体的功能表征
研究首先从人第三磨牙中分离出牙乳头组织，成功提取了原代人牙乳头细胞(hDPCs)。这些细胞表现出典型的成纤维细胞样、纺锤形形态。免疫荧光染色证实其表达间充质标志物波形蛋白(VIM)，而不表达上皮标志物细胞角蛋白14(CK14)，表明其为间充质来源。流式细胞术分析进一步显示，分离的hDPCs高表达间充质干细胞表面标志物CD90、CD29和CD44，而不表达造血标志物CD34和CD45，确认了其间充质干细胞表型。
随后，研究团队通过流式分选技术，从hDPCs中分离出CD24阳性(CD24+)和CD24阴性(CD24?)两个亚群。逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR)分析证实，CD24+hDPCs中CD24mRNA的表达水平显著高于CD24?hDPCs。功能实验显示，CD24+hDPCs展现出更强的碱性磷酸酶(ALP)活性和更多的矿化结节形成（通过ALP和茜素红S(ARS)染色证实），表明其具有更优异的成骨/成牙分化潜能。此外，划痕实验证实CD24+hDPCs的迁移能力也显著强于CD24?hDPCs。这些结果表明，CD24+hDPCs是一个具有增强矿化能力和迁移活性的理想细胞模型。
+亚群的分离、表征和功能优势。展示了hDPCs的形态、表型鉴定、CD24分选、矿化及迁移能力比较。">
CD24+hDPCs通过旁分泌途径增强hDPSCs功能
鉴于牙髓干细胞(hDPSCs)是负责牙本质维持、修复和牙髓组织再生的主要功能细胞群，且损伤后根尖区存在功能活跃的干细胞，研究通过建立Transwell共培养系统，探究CD24+hDPCs是否通过旁分泌作用调控hDPSCs的功能。
细胞计数试剂盒(CCK-8)实验表明，与CD24?hDPCs共培养相比，与CD24+hDPCs共培养能显著促进hDPSCs的增殖。划痕实验进一步证明，与CD24+hDPCs共培养增强了hDPSCs的迁移能力。在成骨诱导7天后，RT-qPCR分析显示，与CD24+hDPCs共培养的hDPSCs中，成骨标志基因骨桥蛋白(OPN)和骨钙素(OCN)的表达显著上调，表明CD24+hDPCs在体外增强了hDPSCs的成骨分化潜能。
为了进一步探究这些旁分泌效应，研究收集了CD24+和CD24?hDPCs的条件培养基(CM)。当hDPSCs用这些CM培养时，与CD24?CM相比，CD24+CM显著促进了hDPSCs的增殖和迁移。考虑到血管生成在牙髓再生中的关键作用，研究进一步评估了CD24+CM对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)功能的影响。与对照培养基相比，CD24+CM显著增强了HUVECs的成管能力（节点数增加），并显著提高了HUVECs的迁移能力。
这些结果表明，CD24+hDPCs通过旁分泌途径释放的生物活性因子，可显著增强hDPSCs的增殖、迁移以及HUVECs的血管生成活性，有助于建立有利于牙髓再生的微环境。
+ hDPCs通过旁分泌信号增强hDPSCs的功能。展示了共培养系统示意图、hDPSCs形态、增殖、迁移及成骨基因表达结果。">
+ hDPCs的条件培养基促进hDPSCs功能和HUVECs血管生成。展示了CM制备流程及其对hDPSCs增殖、迁移，以及HUVECs成管、迁移的影响。">
CD24+来源的细胞外囊泡(EVs)的功能验证
细胞外囊泡(EVs)是旁分泌通讯的重要组成部分。为了评估CD24+EVs在调节hDPSCs和HUVECs功能中的潜在作用，研究通过超速离心法从CD24+和CD24?hDPCs的培养上清中分离出EVs。
透射电子显微镜(TEM)显示，分离的囊泡呈典型的杯状形态，直径小于150纳米，膜结构完整。纳米颗粒跟踪分析(NTA)进一步证实，CD24+和CD24?EVs的尺寸分布与典型的外泌体特征一致。蛋白质印迹法(Western Blot)分析表明，两种EVs均表达外泌体标志蛋白CD63、肿瘤易感基因101蛋白(TSG101)、CD9和热休克蛋白70(HSP70)，而未检测到阴性标志物高尔基体基质蛋白130(GM130)。这些数据表明成功分离了高纯度的EVs。
细胞摄取实验显示，用DiO标记的CD24+EVs能被hDPSCs和HUVECs有效内化。基于hDPSCs增殖筛选，确定20微克/毫升为有效浓度，用于后续体外实验。
接下来，研究考察了CD24+EVs对hDPSCs功能的影响。5-乙炔基-2‘-脱氧尿苷(EdU)染色显示，CD24+EVs显著促进了hDPSCs的增殖。Transwell和划痕实验进一步表明，CD24+EVs处理显著增强了hDPSCs的迁移能力。在成骨诱导后，RT-qPCR分析显示，用CD24+EVs处理的hDPSCs中成骨相关基因表达显著上调。
研究还评估了CD24+EVs对HUVECs的血管生成效应。CD24+EVs处理显著增强了HUVECs的迁移能力。同样，在成管实验中，CD24+EVs诱导节点数显著增加，表明其促血管生成活性增强。
综上所述，源自CD24+hDPCs的EVs重现了其亲本细胞的关键功能优势，能够促进hDPSCs的增殖、迁移和成骨分化，以及HUVECs的血管生成活性，这为后续研究CD24+EVs在支持血管化、功能性牙髓样组织形成中的作用奠定了基础。
+ EVs的表征和体外功能验证。展示了EVs分离流程、形貌与粒径表征、标志蛋白表达、细胞摄取，以及对hDPSCs和HUVECs增殖、迁移、成骨分化、成管能力的影响。">
CD24+EVs在体内驱动结构良好的牙髓再生与成牙本质分化
为了在体内验证CD24+EVs的牙髓再生能力，研究在裸鼠皮下建立了基于处理牙本质基质(TDM)的异位牙髓再生模型。在该模型中，CD24+EVs和hDPSCs被依次加载到TDM腔室的空间分隔区域，以模拟其生理分布。实验设置了三组：对照组（胶原）、CD24?EVs组（胶原负载CD24?EVs）、CD24+EVs组（胶原负载CD24+EVs）。
皮下植入4周后，在所有组中都观察到了新形成的组织。苏木精-伊红(H&E)染色显示，CD24+EVs组的再生组织更致密，单位面积细胞密度显著更高，这与增强的细胞迁移和增殖相一致。Masson三色染色显示，CD24+EVs组有丰富的胶原基质，表明细胞外基质沉积和重塑更活跃。此外，免疫荧光染色显示，CD24+EVs组中成牙本质分化标志物牙本质涎磷蛋白(DSPP)和增殖标志物Ki67的表达显著增加，支持了CD24+EVs在促进成牙本质分化中的作用。
这些发现表明，CD24+EVs不仅促进了细胞迁移和形成细胞更密集的再生组织，还增强了成牙本质分化，从而有助于在体内形成结构良好的牙髓样组织。
+ EVs在体内促进结构良好的牙髓样组织再生和成牙本质分化。展示了TDM异位再生模型示意图、再生组织的H&E染色、Masson染色及DSPP、Ki67免疫荧光结果。">
CD24+EVs促进再生牙髓组织中的血管化
鉴于血管生成对牙髓组织存活和再生至关重要，研究进一步评估了再生牙髓组织内的血管化情况。H&E染色显示，CD24+EVs组包含更多数量的血管和更大的血管面积，大约是CD24?EVs组的三倍。Masson三色染色进一步显示，CD24+EVs组的胶原纤维沉积更丰富、排列更有序。CD31免疫荧光分析表明，与CD24?EVs组和对照组相比，CD24+EVs组的血管内皮细胞密度显著更高，管状结构更有序，同样达到对照组约三倍的水平。α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)免疫组化显示，CD24+EVs组新血管周围α-SMA阳性细胞的覆盖增加，这与更成熟、可能更稳定的微血管网络相一致。
这种优化的血管化微环境有望为定向细胞迁移和定植提供有利条件。使用人特异性抗体NM95进行谱系追踪，观察到CD24+EVs组中，hDPSCs在血管丰富的中央区域定位增加，这表明CD24+EVs增强了根尖区hDPSCs向再生核心的迁移。
这些组织学和免疫组化结果表明，CD24+EVs在体内协同增强了血管化和细胞迁移，支持了其作为再生功能性牙髓策略中关键的无细胞介质的潜力。
+ EVs诱导的再生牙髓样组织内血管化的体内表征。展示了血管密度与面积、胶原与血管结构、CD31阳性血管网络、α-SMA阳性周细胞覆盖以及植入hDPSCs的NM95追踪结果。">
总结与展望
本研究表明，CD24+EVs在细胞辅助EV方法中能够促进牙髓样组织再生。CD24+EVs在体外显著增强了hDPSCs的增殖、迁移和成骨/成牙分化，并同时增强了内皮细胞成管和迁移能力。在基于TDM的异位牙髓再生模型中，CD24+EVs增加了从模拟根尖区加载的hDPSCs向再生部位的迁移，支持了强劲的血管生成，并导致了细胞密集、高度血管化的牙髓样组织的形成。
该研究探讨了细胞异质性与EV异质性之间的潜在联系，提出CD24+EVs继承了其亲本细胞的特化功能属性，从而促进后续再生过程。研究所用的空间分隔TDM再生模型为评估EVs的体内再生潜力提供了一个有用的平台。与直接将细胞放入缺损区的传统策略相比，这种EV介导的引导模式旨在更接近地模拟自然修复过程，并可能降低与直接细胞移植相关的潜在风险。
血管化对于组织再生至关重要。本研究提示，CD24+EVs提供了一种有前景的细胞辅助EV方法来增强血管化。CD24+EVs作为一个多因子信号平台，能够启动和协调血管生成的多个关键步骤。值得注意的是，CD24+EVs对血管生成和成骨/成牙分化的协同诱导，建立了一个加速组织成熟和功能化的支持性微环境。
尽管取得了这些令人鼓舞的发现，但研究也存在一些局限性。例如，未包含EV耗尽的CM对照，未进行EV生物发生或摄取的药理学和遗传学抑制；尚未鉴定出负责这些效应的具体关键分子；缺乏功能性灌注分析（如微血管造影）的直接证据；部分实验样本量相对较小；使用的异位皮下模型未能完全模拟感染牙髓腔内的复杂炎症微环境；未包含单纯TDM支架组和未分选hDPCs EVs组等。未来的研究应优先考虑功能性阻断实验和高通量蛋白质组学或微小RNA(miRNA)谱分析以鉴定关键活性成分，并建立炎症模型和大型动物原位牙髓再生模型，以更严格地评估其转化可行性。
总之，这项工作证明了利用亚群来源的EVs进行牙髓修复的可行性，为从传统的细胞移植向更精确的细胞辅助EV干预的潜在转变提供了实验基础，并为亚群引导的再生治疗提供了框架。
+ EVs分离及其体外和体内再生效应的示意图。">
