: HPV感染状态驱动头颈鳞癌肿瘤微环境NK细胞功能异质性的单细胞图谱与预后标志物鉴定

《Cancers》：Technical Options and Airway Management in Carinal Resections Peter Juhos, Miroslav Janík, Patrik Lau?ek, Jana Kudrnová, Róbert Balá? and Katarína Tarabová

这是一篇聚焦于头颈鳞癌（HNSCC）肿瘤免疫微环境中NK细胞功能分化的高分辨率研究。它揭示了HPV感染状态如何塑造截然不同的NK细胞景观：HPV阳性（HPV+）肿瘤富集具有保护作用的CX3CR1+KLRB1dimNK亚群，而HPV阴性（HPV?）肿瘤则通过上调CLEC2C/D-KLRB1抑制轴来逃逸NK细胞的杀伤。该研究为理解HNSCC的HPV预后分型提供了机制性见解，并提出了具有HPV分型特异性的免疫治疗新靶点。

引言

头颈鳞状细胞癌（HNSCC）是全球发病率排名第五的癌症。其发病机制除传统的烟草和酒精因素外，人乳头瘤病毒（HPV）感染已成为一个明确的病因学因素，并定义了独特的临床实体。一个显著的临床悖论是，尽管源于病毒感染，HPV阳性（HPV⁺）肿瘤与HPV阴性（HPV^?）肿瘤相比，通常具有更有利的预后和更高的生存率。越来越多的证据表明，这种差异可能源于肿瘤免疫微环境（TIME）的组成和功能状态的根本性不同。在TIME的众多细胞成分中，自然杀伤（NK）细胞作为固有免疫系统的关键效应细胞，其功能活性可能受到HPV状态的差异性调节。然而，NK细胞的功能状态是否受到HPV状态的差异性调控，以及这是否有助于解释HNSCC中观察到的预后悖论，仍然是一个未解决的核心问题。

本研究旨在通过以NK细胞为中心，对公开的高分辨率单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据进行再分析，从而构建HPV⁺和HPV^?HNSCC中肿瘤浸润NK（TINK）细胞的综合图谱，以解答上述疑问。

材料与方法

本研究纳入了两个具有明确HPV状态的独立患者队列，分别用于计算再分析和原创验证。

发现队列 包含来自两个公共基因表达综合（GEO）scRNA-seq数据集（GSE139324， GSE164690）的28个HNSCC患者样本（18例HPV^?， 10例HPV⁺），用于计算再分析。

验证队列 包含来自10例接受手术切除的HNSCC患者的福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）组织切片（5例HPV^?， 5例HPV⁺），用于对CLEC2-KLRB1轴进行原创免疫组化（IHC）验证。

对scRNA-seq数据进行了标准的质量控制、批次校正、降维、聚类和细胞类型注释。从整合数据中分选出T细胞和NK细胞进行高分辨率再分析。通过Monocle2进行伪时间轨迹推断，分析NK细胞的发育路径。基于CellChat数据库中的配体-受体对进行细胞间通讯分析，以推断NK亚群与肿瘤细胞之间的相互作用。关键发现通过IHC在独立队列中进行了蛋白水平验证，并使用TCGA-HNSC数据评估了预后关联。

结果

3.1. HNSCC的免疫景观揭示了HPV⁺肿瘤中NK细胞浸润的改变

对28例HNSCC患者的scRNA-seq数据分析发现，HPV⁺肿瘤中B/浆细胞比例显著升高，而树突状细胞、巨噬细胞、单核细胞和NK细胞的比例则显著降低。在NK细胞的功能富集分析中，HPV⁺肿瘤的NK细胞上调基因与抗原呈递、适应性免疫应答和T细胞活化相关，而HPV^?肿瘤的NK细胞上调基因则与先天免疫和抗病毒应答相关。

3.2. 单细胞分析鉴定出HNSCC中四种功能不同的NK细胞亚群

通过对7932个NK细胞的再聚类，研究人员鉴定出四种转录组学上不同的NK细胞亚群：适应性NK细胞、杀伤性NK细胞、CD56^brightNK细胞和病毒应答性NK细胞。伪时间轨迹分析显示，两种HPV状态的NK细胞总体分化路径相似，CD56^brightNK细胞定位于轨迹起点，而杀伤性NK细胞位于终点。发育潜力分析进一步表明，HPV^?肿瘤中的病毒应答性NK亚群比其HPV⁺对应亚群分化程度更低。

3.3. 一个表达CX3CR1的循环NK细胞亚群与HPV⁺HNSCC的有利预后相关

通过评估组织驻留标志物，发现杀伤性NK亚群表达水平最低，提示其可能具有循环样表型。在趋化因子受体中，CX3CR1在杀伤性NK细胞中高表达，尤其在HPV⁺肿瘤中。在批量转录组数据中，CX3CR1及其配体CX3CL1均与NK细胞浸润评分呈正相关。进一步将杀伤性NK群体细分为CX3CR1⁺和CX3CR1^?两个亚群，发现CX3CR1⁺细胞在该亚群中的比例在HPV⁺HNSCC中显著更高。CX3CR1⁺亚群表现出更高的细胞毒性相关基因表达，而CX3CR1^?亚群则上调了抑制/耗竭标志物。重要的是，高浸润的CX3CR1⁺杀伤性NK细胞与HPV⁺HNSCC患者显著改善的总生存期相关，在HPV^?队列中则未观察到这种关联。

3.4. 在独立HNSCC验证队列中对CLEC2-KLRB1轴进行免疫组化验证

细胞间通讯分析显示，与HPV⁺肿瘤相比，HPV^?肿瘤中NK细胞与肿瘤细胞之间的总体相互作用频率降低。在HPV^?HNSCC中，研究人员观察到抑制性HLA-E: CD94-NKG2A/C轴的显著富集。进一步分析强调了肿瘤细胞与杀伤性NK细胞之间特异性参与CLEC2B/C/D-KLRB1抑制轴，且主要存在于HPV^?疾病中。虽然NK细胞上的KLRB1表达在两组肿瘤间无差异，且与预后无关，但配体CLEC2C和CLEC2D在HPV^?队列的肿瘤细胞上表达显著上调。IHC染色证实了HPV^?组织中CLEC2C和CLEC2D的蛋白水平更高。TCGA-HNSC数据分析进一步表明，高CLEC2D表达与不良预后相关，而CLEC2C则无显著关联。

3.5. 预后有利的CX3CR1⁺KLRB1^dimNK细胞在HPV⁺HNSCC中富集

研究人员根据KLRB1表达进一步对CX3CR1⁺杀伤性NK细胞进行分层。在HPV⁺肿瘤中，CX3CR1⁺NK细胞主要是KLRB1低表达/阴性（KLRB1^dim），而HPV^?肿瘤则具有更高频率的CX3CR1⁺KLRB1^highNK细胞。相应地，CX3CR1⁺KLRB1^dim亚群在HPV⁺HNSCC中显著更丰富。功能富集分析显示，CX3CR1⁺KLRB1^dim亚群与适应性免疫和T细胞活化相关，而CX3CR1⁺KLRB1^high亚群则与TNF产生和血小板活化相关。临床上，CX3CR1⁺KLRB1^dimNK细胞的高浸润与改善的患者生存期相关，而CX3CR1⁺KLRB1^high亚群则无预后关联。

3.6. NK细胞与肿瘤细胞相互作用的HPV依赖性调控

研究人员将上述发现整合到一个示意图模型中，总结了HPV依赖性的NK细胞与肿瘤细胞之间的相互作用。在HPV⁺HNSCC中，肿瘤细胞下调CLEC2B/C/D配体并上调CX3CL1。NK细胞，尤其是杀伤性亚群，高表达CX3CR1。由此产生的CX3CR1⁺KLRB1^dimNK细胞表现出推测的循环样转录特征，被推断通过CX3CL1-CX3CR1轴被招募，表现出增强的细胞毒性，并与良好的预后相关。相反，HPV^?肿瘤上调表面CLEC2B/C/D配体，这些配体与NK细胞上的KLRB1结合，抑制其细胞毒性功能并促进耗竭表型，从而促进免疫逃逸和更差的临床结局。

讨论

本研究为HNSCC中的NK细胞景观提供了高分辨率图谱，揭示了由肿瘤HPV状态主导的显著功能二分法。通过将NK细胞异质性解析为四个功能特化的亚群，研究为HPV⁺和HPV^?疾病之间既有的预后差异提供了机制性视角。在预后良好的HPV⁺肿瘤中，观察到了一个保护性CX3CR1⁺KLRB1^dim细胞毒性NK细胞群的显著富集。该亚群的优势意味着一种强大的、推测为循环样的抗肿瘤NK应答。此外，HPV⁺HNSCC中“适应性”NK亚群的突出，其特征是与T细胞活化和抗原呈递相关的基因表达特征，进一步支持了高度协调和有效免疫微环境的概念。

与此形成鲜明对比的是，HPV^?HNSCC的肿瘤微环境似乎主动破坏NK细胞功能。尽管杀伤性NK亚群在HPV^?肿瘤中比例存在，但其细胞毒性效力可能受到一种特异且有效的免疫逃逸机制的损害。分析发现HPV^?肿瘤细胞上CLEC2配体CLEC2C和CLEC2D的上调，它们与NK细胞上的抑制性受体KLRB1结合。这种通过计算预测并经免疫组化验证的相互作用，突显了这种更具侵袭性的疾病亚型中一个主导性的、可靶向的NK细胞抑制轴。

HPV⁺肿瘤中NK细胞浸润减少的观察结果，似乎与先前关于同一患者群体外周血中循环NK细胞数量升高的报告相矛盾。这种差异可能反映了系统免疫与局部肿瘤内免疫活性之间的根本区别。一个合理的解释是，HPV⁺微环境中的慢性免疫激活——可能由CXCL10等因素驱动——诱导NK细胞在进入肿瘤时死亡，导致尽管存在更大的系统储备，但稳态下的肿瘤内计数较低。这突显了本研究的一个关键局限：缺乏配对的外周血样本。未来的研究比较来自同一个体的循环和肿瘤浸润NK细胞，对于充分阐明HNSCC中NK细胞的运输、活化和功能命运至关重要。

结论

总之，本研究系统地描绘了HNSCC中异质性的肿瘤内NK细胞景观，并鉴定出与不同临床结局相关的HPV相关NK细胞生物学功能二分法。通过以NK细胞为中心的scRNA-seq数据再分析以及在独立队列中的原创IHC验证，研究鉴定出四个转录组学上不同的NK细胞亚群和两个关键的HPV分层免疫表型：其一，一个细胞毒性CX3CR1⁺KLRB1^dimNK亚群在HPV⁺HNSCC中特异性富集，并作为一个保护性预后生物标志物（其独立预后价值已通过多变量Cox分析确认）；其二，HPV^?HNSCC肿瘤上调CLEC2C/CLEC2D配体，与NK细胞上的抑制性KLRB1受体结合，形成了一个新的、可靶向的免疫逃逸轴，并在蛋白水平上通过IHC得到了验证。

这些发现为理解HPV⁺和HPV^?HNSCC之间的预后差异提供了一个机制框架，并突显了精准免疫治疗的转化机会。然而，这些发现的临床转化需要在大型、解剖部位匹配的前瞻性队列中进行验证，以区分HPV特异性效应与解剖部位依赖性免疫环境的影响。CX3CR1⁺KLRB1^dimNK亚群是HPV⁺HNSCC一个有希望的预后指标，而CLEC2-KLRB1轴代表了HPV^?HNSCC的一个新的治疗靶点——需要通过体外/体内功能研究来确认其治疗潜力。总之，这项工作强调了HPV分层在剖析HNSCC中肿瘤-NK细胞相互作用方面的至关重要性，并为未来针对HPV⁺和HPV^?疾病不同免疫景观的个性化免疫策略奠定了基础。