《Epigenomes》：Changes in Blood DNA CpG Methylation Levels in Response to Methadone Maintenance Treatment: Epigenome-Wide Longitudinal Study
Orna Levran,
Yuli Kim,
Justin Li,
Anat Sason,
Miriam Adelson and
Einat Peles
1. 引言
阿片类药物使用障碍（OUD）是一项重大的公共卫生挑战，其特点是不顾严重后果的强迫性寻求和使用阿片类药物。阿片类药物在慢性疼痛管理中有重要作用，但其过度处方加剧了阿片类药物的流行。近年来，芬太尼等强效合成阿片类药物的使用有所增加。OUD由生物和环境因素共同导致。阿片滥用会改变大脑奖赏回路，而这些神经适应性变化部分由表观遗传机制介导。尽管通过候选基因和全基因组关联研究（GWAS）已识别出一些OUD的风险变异，但它们只能解释已知遗传力的一小部分。
美沙酮维持治疗（MMT）是治疗阿片成瘾的主要药物疗法之一，另外还包括丁丙诺啡和长效纳曲酮。这些药物以内源性阿片系统中的μ-阿片受体为靶点。MMT的特点是个体间剂量差异巨大，且复发仍然是一个主要挑战。人们对MMT反应的内在机制了解有限。
DNA甲基化以组织特异性方式动态地影响DNA对转录因子和其他调控蛋白的可及性，从而调节基因表达。它可能有助于揭示疾病的病理生理机制，并/或作为生物标志物（例如风险、亚型或治疗反应）。关于血液DNA甲基化与阿片使用的数据有限。一些候选基因研究表明，海洛因成瘾或阿片使用个体的血液DNA甲基化发生了改变。在μ-阿片受体基因（OPRM1）的启动子区域发现了差异性甲基化。一项针对有阿片暴露对照的欧裔美国女性OUD患者的表观基因组关联研究（EWAS），以及一项针对活跃注射吸毒者的EWAS，都报告了几个在全基因组水平上具有显著意义的CpG位点。先前来自我们实验室的甲基化研究采用横断面设计，无法区分OUD和MMT各自的效应。本研究采用纵向方法，旨在通过检查患者在MMT开始时和治疗1-3年后DNA甲基化的变化来区分这两种效应。由于DNA甲基化既是基因表达变化的原因，也是其结果，纵向研究有助于阐明DNA甲基化与特定表型之间的因果关系。这种方法还能减少潜在混杂因素的影响。
本研究的主要目标是检验OUD患者的MMT是否与外周血DNA甲基化水平的变化相关。这些变化可能揭示响应MMT的潜在表观遗传过程，作为生物标志物，或反映治疗的副作用。
2. 结果
研究样本的人口学和临床特征如表1所示。该研究仅包括基于全基因组基因型数据主成分分析（PCA）判断的主要为欧洲和中东血统的受试者。
总共有1881个CpG位点符合差异性甲基化探针（DMP）的标准，显示基线样本和随访样本之间的甲基化水平存在显著差异。分析中控制了组别、年龄、性别、批次、两个人群分层主成分（来自全基因组基因型数据）和六种血细胞类型比例估计值作为协变量（错误发现率FDR < 0.05）。大约16%的DMP位于转录起始位点（TSS200和TSS1500）附近。这些DMP注释到2014个基因。为了减少假阳性，去除了变化微小（|Δβ| < 0.02）的DMP。其余DMP的Δβ值幅度普遍不大，只有一小部分超过±0.05。为减少歧义，将与吸烟相关的DMP（基于EWAS开放平台和其他研究）从最终列表中排除。
表2列出了排名前十的DMPs，标准化β值的小提琴图如图1所示。
在排名靠前的DMPs中，有三个位于调控区域，其中两个位于转录变体的调控区域。CpG cg05766881位于SOX10基因（SRY-box transcription factor 10）一个选择性蛋白质编码转录本（ENST00000698177.1）的5‘非翻译区（UTR），并在其参考转录本的上游。CpG cg25832175位于一个调控区域内，是FAM107B基因一个编码较小蛋白质的选择性转录本（ENST00000479731.5）上游72碱基对处，该区域包含数个转录因子结合位点。CpG cg24917037位于核氧还蛋白样2基因（NXNL2）上游的一个调控区域（启动子，CpG岛），以及一个反义方向的长链非编码RNA（lncRNA）的上游。NXNL2在突触可塑性中起作用。三个排名靠前的DMP位于具有增强子样特征的内含子序列中，可能结合调控蛋白以激活转录。
目前尚不清楚这些DMP是否与基因表达或功能相关，但一些注释到的基因可能具有重要意义。注释到cg25950438和cg05766881的基因（分别是NPAS3和SOX10）编码的转录因子在少突胶质细胞中高表达。注释到cg15924127的基因（DGLUCY）参与D-谷氨酸和D-丝氨酸的代谢，这两种氨基酸是谷氨酸受体至关重要的信号分子。三个排名靠前的DMP注释到在睾丸中高表达的基因（ARGFX和USP37）。CpG cg01235489位于USP37的一个内含子中，在我们的样本中显示出男性和女性之间存在显著的甲基化水平差异（Δβ = 0.056）。然而，MMT对该位点甲基化水平的影响在性别间没有显著差异。
在DMPs中搜索差异性甲基化区域（DMR），发现CD19分子基因（CD19）启动子区域有四个相邻的CpG位点，其甲基化差异方向一致，形成了一个DMR。
在一个显著的DMP集合（n = 1881）中，有注释到已知与成瘾相关表型相关或编码美沙酮靶蛋白的基因的CpG位点，包括ADORA2A、BDNF、CACNA1D、CREB1、CRHR1、CRY1、DNMT3B、GABRD、GNAS、GRIP1、OXR1、PRKACB、SCN2A和SCN3A。此外，一个DMP注释到与美沙酮代谢相关的CYP2C19启动子。
对纵向研究中识别出的DMPs所注释的基因集进行了基因本体（GO）、Reactome和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，以评估其潜在的生物学相关性。这些基因在多个通路中过度富集，包括肌动蛋白细胞骨架组织和由小GTP酶介导的信号转导。
将当前研究确定的DMPs与先前发表的相关研究进行比较发现，cg15924127和cg25950438曾在一项针对欧裔女性OUD患者和具有海洛因暴露对照的EWAS中被指出，尽管它们在那项研究中未达到全基因组显著性设定的阈值。
3. 讨论
本研究的主要目标是检验OUD患者的MMT是否与外周血DNA甲基化水平的变化相关。这些变化可能揭示响应MMT的潜在表观遗传过程，作为生物标志物，或反映治疗的副作用。为此，我们进行了一项纵向研究。据我们所知，这是第一个关于MMT的纵向全表观基因组研究。尽管纵向研究中发现的甲基化水平整体变化幅度不大，但研究识别出几个值得进一步探索的新潜在靶点。
本研究的主要发现之一是，治疗超过1年后，NPAS3基因上的CpG cg25950438甲基化水平升高。目前尚不清楚此DMP是否与基因表达相关。这个CpG位点也曾在一项针对欧裔美国女性OUD患者的EWAS中被指出，尽管未达到全基因组显著性。NPAS3是一种bHLH转录因子，在少突胶质细胞中高表达，并与精神和神经发育障碍有关。值得注意的是，一项使用日本受试者活体脑组织样本的前期研究显示，cg25950438具有较高的脑-血相关性，但一项针对欧洲受试者的类似研究未能重复这一发现。目前，这一发现的临床意义尚不明确。
一个潜在相关的发现是，在MMT期间，cg05766881的甲基化水平降低。这个CpG位点位于SOX10的一个选择性蛋白质编码转录本的5‘UTR。SOX10在少突胶质细胞中高表达。在小鼠中，急性吗啡处理后，观察到伏隔核中Sox10的少突胶质细胞特异性表达减少。此外，在大鼠前额叶皮层中病毒过表达Sox10被证明可以调节海洛因成瘾样行为。
少突胶质细胞是一种胶质细胞，在轴突周围形成髓鞘，在塑造神经传递中起着至关重要的作用。髓鞘可塑性被认为与阿片奖赏和成瘾有关，髓鞘形成是OUD的潜在治疗靶点。胶质细胞在成瘾中的作用可能与药物的作用有关，也可能与复发和戒断引起的细胞失调有关。
另一个感兴趣的潜在基因是核氧还蛋白样2（NXNL2），被认为在突触可塑性中起作用。Nxnl2基因敲除小鼠在恐惧、痛觉敏感、协调性、学习和记忆方面表现出严重的行为缺陷。DGLUCY是另一个感兴趣的潜在基因，因为它参与谷氨酸受体信号分子的代谢。谷氨酸系统在物质成瘾中扮演核心角色。
在CD19启动子区域，一组四个相邻的DMPs以相同方向改变了甲基化水平，形成了一个差异性甲基化区域（DMR）。一项比较多发性硬化症患者与对照组CD19+B细胞的研究也报告了类似的DMR。这个DMR的功能意义尚不确定。CD19是B细胞的关键生物标志物，对免疫反应至关重要。阿片类药物的使用与各种免疫细胞的活化以及慢性炎症生物标志物的升高有关。有研究表明，海洛因成瘾患者的免疫系统异常可以通过MMT得到恢复。
研究还识别出注释到已知与成瘾相关表型相关或编码美沙酮靶蛋白的基因的DMPs，包括ADORA2A、BDNF、CACNA1D、CREB1、CRHR1、CRY1、DNMT3B、GABRD、GNAS、GRIP1、OXR1、PRKACB、SCN2A和SCN3A。尽管其中一些位于调控区域，但仍需进一步研究以评估其功能。
对DMPs注释的基因集进行探索性通路富集分析，以产生假说。分析显示了小GTP酶介导的信号转导通路和肌动蛋白丝组织过程的富集。这些发现很有意思，因为阿片类药物的使用会导致GTPase表达的变化，从而引起多巴胺神经元的细胞骨架重塑和突触变化，导致成瘾和复发。肌动蛋白是膜细胞骨架的主要成分，它与众多蛋白质相互作用，包括像Rho家族GTPase这样的小GTP酶调节蛋白。目前已有兴趣靶向细胞骨架动力学，以纠正药物诱导的大脑可塑性变化，作为物质使用障碍的治疗方法。MMT可能改变了这些GTPase的基因表达，并调节了由OUD引起的大脑可塑性变化。目前尚不清楚本研究中在外周血发现的小幅度甲基化变化是否会引起基因表达的临床相关变化。
一个排名靠前的DMP在我们的队列中显示男性和女性之间存在显著的5.6%差异。DMP cg01235489位于泛素特异性肽酶37（USP37）基因的一个内含子中，该基因在睾丸中高表达。
DNA甲基化存在显著的性别差异。已知表观遗传异常与男性不育有关。阿片滥用影响精子形态和运动能力，并可能导致男性不育。在先前对慢性疼痛患者使用阿片类药物的研究中，男性OPRM1启动子中特定CpG位点的DNA甲基化显著降低。对MMT患者的精液分析显示，与未接受治疗的OUD患者相比，存在精子异常的患者比例较小。当前研究在睾丸中高表达的多个基因中识别出DMPs，包括睾丸特异性的FAM107A。在啮齿类动物中，Fam107a表现出异常形态和精子活力降低。如果血液中不同的DNA甲基化水平引起了基因表达的功能性变化，并且也反映了这些基因在睾丸中的表达，这可能暗示了海洛因滥用和MMT影响男性生育力的机制。
正如预期，本研究中的绝大多数患者是当前或既往的香烟吸烟者。吸烟会诱导CpG甲基化，其中一些变化可能在戒烟后持续数年。为了减少歧义，并识别与烟草无关的表观遗传变化，已报告的吸烟相关CpGs被单独列出。
本研究中识别的几个DMPs先前在一项针对欧裔女性和具有海洛因暴露对照的OUD患者的横断面EWAS中被识别出来。这些DMPs在先前研究中非常显著，但未达到设定的全基因组显著性阈值。DNA甲基化既可以是药物滥用的原因，也可以是其结果。然而，针对OUD患者和对照的EWAS无法区分海洛因滥用、OUD的遗传易感性或治疗效果的各自影响。如果在OUD的EWAS和本研究中均被识别的DMPs最终被证明能调控基因表达，那么它们很可能与OUD的遗传易感性无关。
本研究使用血液作为大脑的替代组织，来研究免疫系统中的表观遗传变化。中枢神经系统-免疫系统之间存在双向相互作用。外周免疫细胞和外周释放的细胞因子可以渗入大脑，并促进胶质细胞的活化。目前尚不清楚血液DMPs在大脑中扮演什么角色，但它们有潜力作为生物标志物。少量CpG位点具有较高的脑-血相关性。
在解释结果时需要考虑几个问题。当前MMT与DNA甲基化差异相关的证据是相关性证据。目前尚不清楚DMPs是否与基因表达或功能相关。此外，许多DMPs没有注释到任何基因，而其他一些注释到附近的基因。目前阶段无法确定这些DMPs是否具有治疗价值，是反映了MMT对OUD效应的缓解，还是MMT的副作用。另一个局限性是，我们无法在治疗开始前获得大部分血液样本，而这本是更理想的研究设计。
效应量小表明差异只发生在一小部分细胞中。然而，这种差异可能影响这些细胞的功能，并可能仍然对表型产生显著影响。其他研究也报告了类似规模的小效应量。本研究的其他局限性包括样本量以及未考虑到的技术和生物学混杂因素。一些潜在的残留混杂因素，如可卡因和苯二氮卓类药物的使用以及共病，在不显著减少样本量或影响模型稳定性的情况下无法纳入分析。
本研究的主要发现是，在美沙酮维持治疗1-3年后，外周血中大量CpG位点的甲基化水平发生了适度变化。目前尚不清楚这些DMPs是否会引起基因表达的功能性变化。其中一些DMPs注释到潜在的感兴趣基因，包括转录因子、参与突触可塑性的基因、小GTP酶介导的信号转导、肌动蛋白丝组织、谷氨酸受体信号分子以及与成瘾相关表型相关的基因。一些DMPs位于调控区域，一些在之前的OUD EWAS中被指出。
总之，这项探索性研究为MMT的表观遗传效应提供了见解。未来的研究需要证实和验证这些初步发现，评估它们对基因表达的影响，并确定其临床相关性。
4. 材料与方法
4.1. 研究样本
OUD患者从特拉维夫苏拉斯基医学中心的The Dr. Miriam & Sheldon G. Adelson Clinic for Drug Abuse Treatment & Research招募。所有个体都有一年或以上的每日多次阿片类药物使用史，并至少有一次在戒毒中心戒断或失败的经历。临床细节使用Kreek-McHugh-Schluger-Kellogg（KMSK）量表、成瘾严重程度指数和精神障碍诊断与统计手册第四版（DSM-IV）收集。
仅纳入自我报告并经主成分分析PCA判断为主要为欧洲和中东血统的患者。受试者被纳入研究的条件是，从中提取DNA的血液样本是在治疗开始时和治疗后3年内采集的。如果当前MMT不是其首次治疗，则受试者不被纳入研究。如果受试者在治疗期间海洛因检测呈阳性，也不会被排除在研究之外。所有受试者都签署了遗传学研究的知情同意书。该研究获得了特拉维夫苏拉斯基医学中心和洛克菲勒大学医院伦理审查委员会的批准。
4.2. 全基因组SNP基因分型
使用Puregene Blood Kit从外周血全血中提取基因组DNA。使用Qubit? 3.0荧光计对DNA进行定量。基因分型在西奈山Icahn Institute for Genomics and Multiscale Biology使用Illumina Infinium Global Screening Array进行。参考样本也通过Smokescreen?基因分型阵列进行了基因分型。使用Genome Studio软件基因分型模块v2分析数据。质量控制还使用了以下标准：个体水平检测到的SNPs > 99%；SNP水平基因型检出率 > 99%；以及哈迪-温伯格平衡检验p值 > 1×10?6。检出率低于98%的个体被排除。检查基因型与EPIC阵列上SNP探针所获数据的一致性。所需的最低SNP一致性为0.99，单个样本所需的最低一致性为0.9。
4.3. 主成分分析（PCA）
使用PLINK，利用来自欧洲、非洲、中亚和远东的参考样本以及所有研究样本经过过滤的全基因组SNP集进行PCA。移除了极端离群样本。两个主成分解释了该样本集中大部分的变异性，并被纳入分析作为协变量。
4.4. DNA甲基化分析
使用Premium Bisulfite kit，通过Hologic Diagenode的表观基因组学服务，对1微克DNA进行亚硫酸氢盐转化处理。使用Illumina Infinium Human Methylation EPIC BeadChip array（分别针对v1.0和v2.0版本）对超过850,000个基因组范围内具有生物学显著区域的甲基化位点进行DNA甲基化（5-甲基胞嘧啶）定量。
