《Analytica Chimica Acta》：CM-TRAP: A Chemoproteomic Workflow for Profiling Circulating Metabolites and Their Protein Targets in Alzheimer's Disease
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阿尔茨海默病（AD）代谢组学分析及CM-TRAP方法建立，通过LC-MS/MS和TRAP化学蛋白质组学，揭示5×FAD小鼠模型CSF和血清中阶段特异性代谢改变，发现早期嘌呤代谢紊乱和晚期氨基酸/糖酵解异常，鉴定xanthine作为促炎介质，并确定PEPD和PSAP为关键靶向蛋白，为AD代谢-蛋白互作机制提供新工具。
王新苗|何向宇|蒲晓宇|杨行超|李毅|张汉清|郝海平|邵昌|叶辉
中国药科大学天然药物国家重点实验室，南京210009，中国
摘要
背景
代谢物不仅作为代谢中间体，还作为强大的信号分子来调控细胞命运。然而，在复杂的病理生理环境中解码特定的“代谢物-靶点-表型”轴仍然是一个主要挑战，这主要是由于缺乏系统的靶点去卷积策略。在这里，我们开发了循环代谢物-靶点响应性可及性分析（CM-TRAP），这是一种整合的多组学工作流程，将非靶向代谢组学筛查与基于TRAP的化学蛋白质组学靶点发现相结合。这一分析框架能够直接将疾病特征性的代谢改变与其分子靶点联系起来。
结果
为了研究循环代谢物在阿尔茨海默病（AD）进展过程中的信号作用，我们对3个月和12个月大的5×FAD转基因小鼠的脑脊液（CSF）和血清进行了全面的代谢组学分析，这种小鼠模型是AD的公认模型。我们发现CSF中嘌呤代谢在早期出现紊乱，而氨基酸和糖酵解途径在后期发生改变。具体来说，黄嘌呤是一种在AD CSF中显著升高的关键阶段依赖性代谢物。功能上，黄嘌呤作为一种促炎调节剂，在BV2小胶质细胞中以剂量依赖的方式增强LPS诱导的IL-6分泌。为了将这种促炎表型与分子功能联系起来，我们应用基于TRAP的化学蛋白质组学方法对黄嘌呤进行了剂量依赖性的结构分析，从而确定了肽酶D（PEPD）和prosaposin（PSAP）作为可能在神经炎症调节中起作用的候选靶点。
意义
CM-TRAP建立了一种有效的分析策略，可以将代谢改变与候选蛋白质靶点功能性地联系起来，为理解代谢物相关的神经炎症提供了框架。黄嘌呤作为促炎介质的鉴定及其与PEPD和PSAP的相互作用，提供了关于特定阶段代谢物如何重塑小胶质细胞蛋白质组以传播炎症信号的位点解析见解。通过进一步验证，这一平台可以广泛应用于发现不同疾病背景下的生物活性代谢物及其相应靶点。
引言
越来越多的证据表明，代谢物不仅是有价值的诊断标志物或生物合成中间体，还是调控细胞命运和系统稳态的强大信号分子[1]、[2]、[3]。特别是在AD中，代谢功能障碍不仅是一个旁观者，还是通过多种相互交织的机制加速病理进展的驱动因素[4]、[5]。这种代谢重布表现出明显的时空动态，在疾病的早期阶段通常表现为微妙的先兆波动[6]、[7]，而中期到晚期阶段则伴随着广泛的代谢重布，这与认知衰退和神经病理学积累相平行[8]。因此，对特定阶段代谢景观的纵向表征对于揭示代谢失调与疾病进展之间的时间因果关系至关重要，为精确的治疗干预提供了路线图。
脑脊液（CSF）和血清是了解AD代谢组的互补窗口。CSF作为与中枢神经系统（CNS）的接口，可以直接反映大脑的代谢状态[9]、[10]，而血清则反映了具有转化诊断价值的系统改变[11]。因此，跨这些区域的整合代谢组学分析能够实现代谢重布的时空映射，有助于开发针对脑-外周代谢轴的疗法[12]。
尽管已经鉴定出许多与AD相关的代谢紊乱，但仍存在一个关键问题：如何将这些代谢特征转化为机制靶点。在体内识别能够识别特征性代谢物的传感器蛋白仍然是一个主要瓶颈。传统的靶点去卷积方法，如热蛋白质组学分析（TPP）、细胞热位移测定（CETSA）和药物亲和力响应性靶点稳定性（DARTS），可以提供在完整蛋白质水平上的可靠配体结合读数[13]、[14]、[15]。虽然这些基于稳定性的方法对于检测代谢物靶点结合有效，但通常无法解析特定的结合界面。有限的可溶性蛋白质谱（LiP-MS）能够在肽水平上映射构象响应区域，但涉及复杂的数据处理，并且往往不适用于耐酶的蛋白质复合物[16]。为了克服这些限制，我们采用了TRAP，这是一种化学蛋白质组学策略，利用赖氨酸定向二甲基化标记来监测配体结合后的蛋白质组范围内的可及性变化[17]、[18]。与蛋白质水平稳定性测定或依赖蛋白酶的方法不同，TRAP使用小分子化学探针来捕获位点解析的可及性变化，从而能够精确识别和定位配体响应界面和构象热点。TRAP已成功应用于解卷积药物剂如水飞蓟素[19]、芹菜素[20]和洛贝林[21]的靶点，以及在不同刺激下动态蛋白质结构的映射[22]，证明了其在机制导向研究中的稳健性。
基于这一基础，我们建立了CM-TRAP，这是一种将基于液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的非靶向代谢组学分析与TRAP化学蛋白质组学相结合的工作流程，将CSF和血清中的AD相关循环代谢物与其候选响应蛋白效应物联系起来。在CM-TRAP中，首先进行非靶向代谢组学分析以描绘特定阶段和区域的代谢改变，然后优先选择代谢物进行TRAP分析，以捕捉代谢物响应的蛋白质组可及性变化并提名潜在的响应靶点。使用3个月和12个月大的5×FAD转基因小鼠作为早期和晚期AD病理的模型，我们系统地描绘了特定阶段的代谢紊乱。我们的分析揭示了CSF中嘌呤代谢的早期失调以及氨基酸代谢和糖酵解的后期改变。我们还观察到了区域化的紊乱，其中CNS和外周代谢物表现出不同的通路富集模式。值得注意的是，我们鉴定出黄嘌呤是一种关键阶段依赖性代谢物，在体外小胶质细胞模型中增强了LPS诱导的促炎IL-6分泌。此外，将TRAP分析应用于这种代谢物使我们能够映射其构象调节，并确定PEPD和PSAP作为候选的功能效应器。总体而言，CM-TRAP提供了一个全面的分析框架，直接将疾病相关的代谢特征与其候选分子靶点联系起来，为AD进展提供了潜在的见解，并支持未来“代谢物驱动”的治疗策略的发现。
章节片段
细胞培养
小鼠小胶质BV2细胞系购自中国科学院细胞库（上海，中国），并在37°C、5% CO2的湿润培养箱中维持。细胞在Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM，Gibco）中培养，补充10%（v/v）胎牛血清（FBS，南美洲来源，Gibco）、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素（Thermo Fisher Scientific）。
AD发病机制中的代谢组学分析
为了系统地桥接疾病相关的代谢改变与其分子效应物之间的联系，我们开发了CM-TRAP，这是一种结合非靶向代谢组学与基于TRAP的化学蛋白质组学的整合工作流程。我们首先应用这一分析框架，通过基于LC-MS/MS的非靶向代谢组学来分析AD发病机制中的代谢改变。
使用不同阶段的5×FAD转基因小鼠模型，我们最初对
结论
在这项研究中，我们建立了CM-TRAP，这是一种旨在桥接代谢生物标志物发现与蛋白质靶点鉴定之间差距的整合分析工作流程。通过将非靶向代谢组学与基于TRAP的化学蛋白质组学相结合，我们使用5×FAD转基因小鼠模型描绘了AD进展的特定阶段和区域的代谢景观。这种方法确定了CSF中黄嘌呤的早期积累，这可能是与AD相关的潜在代谢特征。
CRediT作者贡献声明
李毅：方法学、数据管理。蒲晓宇：可视化、数据管理。杨行超：方法学、数据管理。王新苗：撰写——初稿、可视化、验证、方法学、正式分析、数据管理。何向宇：验证、方法学、数据管理。张汉清：方法学。郝海平：资源获取、资金筹集、概念构思。邵昌：撰写——审稿与编辑、可视化、数据管理。叶辉：撰写——审稿与编辑、资金筹集
数据可用性
本研究中使用的蛋白质组学实验数据已存储在ProteomeXchange联盟中，可以通过iProX合作伙伴存储库访问，数据集标识符为PXD069747。
利益冲突声明
? 作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（项目编号82322068给予H.Y.，项目编号82404703给予C.S.，项目编号82321005给予H.H.）、江苏省自然科学基金（项目编号BK20241590给予C.S.）、海外专家引进项目促进学科创新（项目编号G20582017001给予H.H.）、中国药科大学天然药物国家重点实验室的项目（项目编号SKLNMKF202504、SKLNMZZ202506给予H.Y.，SKLNMZZ202402给予H.H.）的支持。
