《Genes》：Elucidation of Response Mechanism of Potato to Nitrogen Stress by Physiological and Transcriptional Analyses
Kaixin Ding,
Ying Shan,
Lichun Wang,
Jiling Song,
Mengping Yang,
Yong Zhang,
Lei Wang,
Xuhong Sun,
Mingxue Li and
Haiyan Wang
+ 2 authors
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本研究通过生理与转录组学分析，系统揭示了不同氮水平对马铃薯块茎形成的调控机制。发现氮缺乏导致匍匐茎细胞壁增厚、叶绿素含量下降，而氮过量则延迟成熟。研究鉴定了包括多聚泛素类似物、生长素响应因子7样蛋白等在内的枢纽基因，并揭示了C2H2、WRKY、ARF等转录因子在调控网络中的核心作用，为提升马铃薯氮素利用效率提供了新见解。
内容摘要
1. 引言
马铃薯是全球第三大粮食作物，其块茎是重要的收获器官，其形成受环境、激素、碳水化合物及信号分子等多种因素调控。氮作为植物必需的宏量元素，参与蛋白质、核酸等生物活性物质的合成，对块茎的发育至关重要。然而，关于氮调控马铃薯块茎形成的生理与分子机制仍不甚明晰。本研究旨在通过结合生理、生化和分子手段，系统解析不同氮浓度对马铃薯块茎化的调控作用，鉴定关键基因与代谢通路，为培育高氮效马铃薯品种提供理论依据。
2. 材料与方法
本研究以马铃薯品种克新37为材料，设置了三种氮处理：氮缺乏(N0)、常规氮(N1)和过量氮(N2)。在块茎形成初期取样，测定植株形态、生理生化指标及产量构成。利用透射电镜观察匍匐茎细胞超微结构。对匍匐茎组织进行RNA测序(RNA-seq)，通过生物信息学分析筛选差异表达基因(DEGs)，并进行基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析。进一步，利用加权基因共表达网络分析(WGCNA)构建基因共表达网络，筛选与性状相关的关键模块及枢纽基因。通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)验证测序结果。
3. 结果
3.1. 不同氮水平下马铃薯植株的形态响应
与常规氮(N1)处理相比，氮缺乏(N0)显著降低了株高、叶绿素含量、单株干物重和氮积累量，降幅分别为27.13%、19.84%、25.92%和52.05%。而过量氮(N2)处理则使这些指标分别显著增加了19.91%、7.64%、23.16%和38.30%。
3.2. 不同氮水平下马铃薯匍匐茎细胞的超微结构变化
透射电镜观察显示，与过量氮处理相比，不施氮处理导致马铃薯匍匐茎中线粒体数量减少但体积增大，细胞间隙扩大，细胞壁和质膜增厚。
3.3. 转录组测序数据质量评估与差异表达基因分析
共获得4.63亿条高质量测序数据。在N0 vs. N1和N2 vs. N1两个比较组中，分别鉴定到1513和1762个差异表达基因(DEGs)，其中256个为两组共有基因。对共有DEGs的KEGG富集分析显示，它们主要富集在激素信号转导、蛋白质加工、萜类/碳水化合物代谢及植物-病原互作等通路。
3.4. 差异表达基因的GO与KEGG通路分析
GO富集分析表明，在N0 vs. N1中，DEGs主要富集在蛋白质重折叠、阴离子反向转运活性等条目，反映了植株对氮缺乏的适应性响应。在N2 vs. N1中，DEGs则主要富集在DNA依赖的DNA复制、细胞分裂素代谢过程等条目，暗示过量氮促进了细胞增殖并调控了激素代谢。KEGG分析显示，在N0 vs. N1中，内质网中的蛋白质加工、ABC转运蛋白、油菜素内酯生物合成等通路显著富集；在N2 vs. N1中，昼夜节律-植物、核糖体、淀粉和蔗糖代谢等通路显著富集。
3.5. 共表达网络构建与模块分析
通过WGCNA分析，将所有基因划分为27个共表达模块。相关性分析发现，叶绿素含量、干物重和氮积累量与orangered1模块呈显著正相关，与blue2模块呈显著负相关。因此，这两个模块被确定为与氮响应性状相关的关键模块。
3.6. 候选模块中枢纽基因与转录因子的鉴定
在blue2和orangered1模块中，分别筛选出173个和8个枢纽基因。GO和KEGG分析显示，这些基因主要富集在生长素激活的信号通路、跨膜运输、植物激素信号转导等生物过程。通过构建共表达网络，鉴定出LOC102586619 (多聚泛素类似物)、LOC102594021 (生长素响应因子7样)、LOC102603216 (蛋白RRP6样2) 和LOC102604588 (泛素受体RAD23d) 为核心枢纽基因。同时，发现WRKY、C2H2和ARF等转录因子(TFs)与这些枢纽基因高度互连，可能在调控网络中起核心作用。
这些枢纽基因的表达模式分析显示，多聚泛素类似物、泛素受体RAD23d和蛋白RRP6样2在氮缺乏条件下表达下调，在过量氮条件下表达上调；而生长素响应因子7样在过量氮条件下表达上调。
3.7. 不同氮水平下马铃薯产量及产量构成的变化
与常规氮处理相比，氮缺乏和过量氮处理均显著降低了单株块茎重量、商品薯率和单株块茎干重。过量氮处理虽显著增加了单株块茎数量，但形成了过多的小薯，导致商品率下降。
4. 讨论
氮缺乏通过改变匍匐茎细胞超微结构（如细胞壁和质膜增厚、线粒体减少），阻碍同化物的运输与能量供应，导致块茎形成提前但发育受阻，最终产量和商品率显著降低。过量氮则促使植株营养生长过旺，延迟了生长中心向地下部的转移，从而推迟块茎形成，产生大量小薯。转录组分析揭示，氮胁迫响应基因主要富集在物质运输、细胞分裂和碳水化合物代谢相关通路。WGCNA进一步筛选出与性状密切相关的关键模块及枢纽基因。多聚泛素类似物、泛素受体RAD23d和蛋白RRP6样2可能通过泛素-蛋白酶体途径(UPS)参与氮调控的蛋白质降解过程，从而影响块茎发育。C2H2、WRKY和ARF等转录因子家族被鉴定为调控网络中的关键调节因子，它们可能通过功能交叉对话，共同调节下游靶基因的表达，以响应氮胁迫并调控块茎形成。本研究提出了一个氮调控马铃薯块茎形成的潜在网络模型：氮水平通过影响UPS通路（涉及多聚泛素类似物、RAD23d等）和植物激素（尤其是生长素）信号转导（涉及ARF），并受到C2H2、WRKY等转录因子的调控，从而综合调控匍匐茎向块茎转化的发育进程。
5. 结论
本研究从生理和转录组水平阐明了马铃薯块茎形成对氮供应的响应机制。氮缺乏导致匍匐茎细胞结构改变，促使块茎早形成但产量品质下降；过量氮则延迟块茎形成并产生过多小薯。通过转录组与WGCNA分析，鉴定出多聚泛素类似物、生长素响应因子7样、蛋白RRP6样2等枢纽基因，其表达可能受C2H2、WRKY、ARF等转录因子调控。这些基因为培育氮高效利用的马铃薯品种提供了潜在的分子标记与靶点，对推动马铃薯可持续生产具有重要意义。然而，其中具体的分子互作与调控机制仍有待进一步验证与深入探究。
