《Genes》：Short-Term Epigenetic Responses of Pinus brutia to Fire Stress: Insights from a Prescribed Burning in Greece
Evangelia V. Avramidou,
Evangelia Korakaki,
Nikolaos Oikonomakis and
Miltiadis Athanasiou
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本文探讨了火后地中海松（Pinus brutia）的表观遗传动态，揭示了计划火烧如何快速诱导其DNA甲基化等表观遗传变异。研究通过MSAP分析发现火灾后多态性表位点和表观遗传多样性指数显著升高，并与水势（Ψ）和火线强度（FI）存在关联。这项工作为理解树木对热胁迫的表观遗传适应机制提供了新见解，对森林生态系统的保护与管理具有潜在意义。
1. 引言
火与热胁迫是塑造森林树种（包括松树）进化和适应性的主要环境压力。虽然松树对火的生理和形态适应（如迟熟性和厚树皮）已被充分记录，但新出现的证据表明，表观遗传机制可能在介导热胁迫响应中发挥关键作用。表观遗传修饰，如DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA，可以在不改变底层DNA序列的情况下调节基因表达，使树木能够快速适应不断变化的环境。在松树物种中，暴露于火或热可能会触发此类修饰，导致“胁迫记忆”，这种记忆可以持续存在，并可能跨代传递。例如，在地中海松和海岸松中，与火相关的选择与适应性性状（如迟熟性）有关，这可能部分受表观遗传控制。了解火诱导的表观遗传重编程如何在松树中发生，不仅对进化生物学至关重要，而且对于气候变化和火情恶化的背景下的森林管理和保护也至关重要。另一个需要考虑的参数是[7]所指出的，被烧和未被烧植物表型的变化，这可能会影响植物-动物的相互作用。
2. 材料与方法
2.1. 研究地点
2021年，希腊希俄斯岛启动了一项针对地中海松（Pinus brutia）生态系统的计划火烧试点项目。在计划火烧实施前、中、后测量了一系列参数，包括气象条件和火焰长度。利用记录的火焰长度值，我们随后计算了火线强度。
火焰长度的测量是在一个相对平坦的区域遵循特定程序进行的。测量过程包括：使用GPS设备获取观测者位置的地理坐标；使用佳能EOS 70D数码单反相机在地面连续位置拍摄火场边界的图像；用指南针记录每张照片的水平方位角；相机自动在数字图像文件中嵌入元数据，包括每张照片的拍摄时间。使用简单的几何技术计算火焰长度。由于每次观测都有时间戳，因此可以直接与独立进行的精细活体或死体燃料水分测量进行配对。
然后根据燃料类型和观测到的火焰长度，使用适当的方法从火焰长度计算火线强度。具体而言，我们使用了以下方程：
(a) 对于以刺叶豆为主灌木丛的火行为，使用Fernandes等人开发的方程计算FI。
(b) 对于地中海松林凋落物和下层灌木的火行为，使用Nelson和Adkins开发的方程计算FI。
气象数据通过直接的野外测量获得，而燃料特征则使用专门为燃料类型开发的函数推断。火灾蔓延速率由作者直接测量。因此，根据[25]，用于评估气象条件、描述森林燃料以及记录火灾蔓延速率和火行为的方法和测量技术的可靠性是最高的。
2.2. DNA采样与提取
在计划火烧前和结束后立即从相同的四棵树上采集针叶进行DNA提取。出于本研究的目的是，将火烧前和火烧后收集的样本视为指示性种群。使用商业植物DNA提取试剂盒提取基因组DNA，并使用紫外分光光度计测量DNA浓度。
2.3. 甲基化敏感扩增多态性（MSAP）流程
使用表1所示的引物以及EcoRI/HpaII或EcoRI/MspI限制性内切酶进行双酶切来进行MSAP分析。整个流程在我们之前的出版物中有详细描述。此外，使用三个样品作为重复分析，采用相同的DNA提取物进行MSAP分析。
来自GeneMapper 4.0的等位基因大小数据被转换为二进制格式用于MSAP分析。然后，使用Excel宏标记等位基因大小，如果存在则标记为1，如果不存在则标记为0。通过仅考虑和分析150到500个碱基对之间的可重复片段，最大限度地减少了潜在的尺寸同塑性。此外，EcoRI/HpaII和EcoRI/MspI反应的条带模式比较结果根据[28]呈现为四种可能的片段状态：(I) 两个图谱中都存在的片段，表示未甲基化状态；(II) 仅存在于EcoRI/MspI图谱中的片段，表示半或完全甲基化的CG位点；(III) 仅存在于EcoRI/HpaII图谱中的片段，提示为半甲基化的CHG位点；(IV) 两个图谱中均不存在的片段，代表一种无信息状态，可能由各种甲基化类型或限制性位点多态性导致。为了区分未甲基化和甲基化片段，并评估甲基化条件II和III的具体影响，采用了“混合评分2”方法。
2.4. 针叶水势
在计划火烧前后，对环境条件一致生长的松树测量了针叶水势。表观遗传采样中使用的相同的四个个体被纳入这些测量。每个自然种群采样四棵地中海松个体。使用便携式压力室在10:00至13:00之间进行水势测量。
2.5. 统计分析
使用R统计计算软件环境进行数据处理和统计分析。为了评估火线强度与生态指数之间的关系，我们使用了皮尔逊积矩相关系数和普通最小二乘法线性回归。考虑到数据集大小的限制，所有回归分析均以探索性形式呈现。使用决定系数和估计标准误差评估模型性能。为了考虑小样本量固有的统计不确定性，我们计算并可视化了所有回归斜率的95%置信区间。尽管样本量限制了正态性检验的效力，但选择皮尔逊相关系数来专门评估火线强度与Iepi之间关系的线性。由于非参数秩方法仅评估单调排序，不能量化潜在强度校准所需的线性比例关系，因此未使用。火烧前后状态之间的差异通过指数值的配对比较进行评估。所有图形可视化均使用ggplot2和ggpubr包生成。
3. 结果
观测到的火线强度在0.5到2米之间变化，对应的火线强度为118到3216 kW·m?1。这些观测是在温和天气条件下进行的，气温为16°C，相对湿度62%，有微风。
3.1. 表观遗传学结果
使用了六种MSAP选择性引物组合，为本研究中的两个种群产生了746个片段。关于火烧前后种群位点的表观遗传参数结果不同。火烧后和火烧前种群的平均多态性百分比分别为91.29%和38.34%。平均无偏杂合度、平均表观遗传香农指数、私有表观遗传条带数量在火烧后均更高，表明树木在处理所发生的热胁迫时存在塑性响应。根据重复样品估计的基因分型错误率约为2-3%。
分子方差分析显示，所有表位点中，91%的表观遗传变异存在于种群内，仅有9%存在于种群间。
对(1)所有等位基因、(2)m等位基因、(3)h等位基因和(4)u等位基因进行的主坐标分析，分别解释了总变异的39.40%、34.83%、38.61%和39.37%。
3.2. 针叶水势与表观遗传香农指数的相关性
针叶水势与Iepi之间存在指示性的强相关性。此外，观察到火烧前和火烧后样品之间存在明显的分离：火烧后样品表现出最高的Iepi值，而火烧前样品表现出最低值。
2022年12月7日空气温度和相对湿度的日变化过程解释了观测到的蒸汽压亏缺变化。随着午后气温从上午晚些时候开始升高并在14:00左右达到最高，相对湿度相应下降。这种高温和大气湿度降低的结合导致了午后蒸汽压亏缺的显著增加。随后，温度的降低和相对湿度的同时升高导致蒸汽压亏缺逐渐减小。
我们还使用相关性来评估火烧前Iepi与火线强度值以及火烧后的关系。鉴于有限的样本量，火线强度与Iepi指数之间的关系被定性为探索性的。虽然火烧后观察到强烈的正线性趋势，但斜率的95%置信区间跨越零点，反映了小数据集相关的统计不确定性。
值得注意的是，分析显示，强烈的火烧前/后分离主导了信号。火烧事件后，平均指数值立即增加了Δ = 0.244。这表明火灾的发生与否是导致指数变化的主要驱动力，而具体的火线强度起着次要的调节作用。线性模型中的剩余方差可能归因于未被火线强度指标明确捕捉的混杂局部因素，如土壤水分异质性或停留时间的变化。
4. 讨论
气候变化对森林健康构成重大威胁，使得适应对于维持森林恢复力至关重要。树木作为固着生物，可以通过调整其表型来应对环境变化。虽然自然选择可以驱动遗传适应，但这个过程很缓慢，尤其是在长寿物种中。一个更快的替代机制是表型可塑性，通常由表观遗传机制调节，这允许在代内和代际间进行更快的调整。尽管火灾和温度上升会显著影响树木死亡率，但关于森林树木表观遗传完整性的研究很少。极端高温事件（如热浪）的频率正在上升，并可能导致树木死亡。植物对高温的响应也受表观遗传学影响。Lamelas等人在2020年研究了辐射松在热胁迫下的情况，追踪了针叶中的蛋白质表达和DNA甲基化。他们发现了与染色质重组相关的蛋白质，表明表观遗传参与热启动，这得到了热胁迫标志物如热休克蛋白的支持。另一个热胁迫的例子涉及栓皮栎。当8个月大的栓皮栎树在12天内经历从25°C到55°C的温度斜坡时，发现全基因组甲基化增加了0.5%，组蛋白乙酰化减少，表明表观遗传机制有助于耐热性。
在此，我们研究了火烧前后的地中海松种群，以明确树木在计划火烧实验下面临的温度胁迫是否改变了其表观遗传时间完整性。我们研究了计划火烧前后相同树木针叶中发生的变化。我们的结果与上述对辐射松和栓皮栎的深入实验结果一致，并指出全基因组DNA甲基化表位点的增加。我们的结果显示，与同一树木的火烧前样本相比，火烧后样本的表观遗传多样性指数值更高。重要的是，这些变化应被解释为反映了甲基化敏感CCGG位点变异性的增加，而不是整体基因组甲基化水平的直接或全面增加。鉴于MSAP方法的位点特异性，无法得出关于整个基因组总甲基化水平的结论。这些初步结果可以为进一步开发积累温度升高的基因奠定基础。此外，如果我们考虑到地中海松具有增强野火恢复力的性状，如厚树皮、快速生长以及通过种子萌发和再萌芽进行再生的能力，我们可能将其温度恢复力与这些表观遗传时间变化联系起来。
在计划火烧的背景下，大量研究表明生物多样性得到增强，同时，树木可以通过表观遗传修饰强烈适应火灾胁迫。在本研究中，正午水势与表观遗传多样性指数之间的相关性揭示了火烧前和火烧后样本之间的明显分离。火烧后样本以较高的Iepi值为特征，而火烧前样本表现出较低的值。虽然这种模式暗示了火灾暴露与表观遗传变异性增加之间的关联，但必须谨慎解释。观察到的关系很可能反映了采样期之间的强烈时间分离，而不是水势与表观遗传多样性之间的直接生理联系。此外，正午水势对短期大气条件高度敏感，例如蒸汽压亏缺，这可能促成了观察到的差异。因此，即使是相对温和的胁迫条件也可能触发或放大MSAP标记可检测到的表观遗传响应。
关于火线强度与Iepi之间的关系，相关系数值较大，但由于样本量非常小，不具有统计学显著性。因此，这些结果被认为是探索性的和假设生成性的。虽然它们与树木可能通过表观遗传机制对增加的火灾强度做出响应的观点一致，但需要额外的数据来稳健地评估这种关联的强度和显著性。
此外，应该提到，本研究中呈现的相关性分析受到小样本量的限制，这降低了统计效力，并排除了更稳健的推断方法。此外，火烧前后采样期之间的强烈分离可能会混淆观察到的关系，特别是对于高度受蒸汽压亏缺等环境条件影响的正午水势。因此，报告的相关性应被解释为探索性的，并主要用于指导未来具有增加重复和更精细时间分辨率的研究。
关于树木种群的表观遗传状态是否提供了有价值的见解，可以显著地为保护和森林管理策略提供信息这个问题，我们可以将其与识别表观遗传生物标志物联系起来。通过描述不同区域的表观遗传景观，研究人员可以精确定位针对环境胁迫的生物标志物。这些生物标志物能够快速评估树木种群的胁迫水平或整体健康状况，比传统的生态生理性状或种群统计指标提供信息快得多。
表观遗传信息也可能有助于识别那些似乎已预先适应环境条件的树木种群。这些种群可以被优先考虑作为造林或恢复计划的材料来源，从而增加在挑战性条件下种植的树木成功建立和持续生存的可能性。此外，有益表观遗传修饰跨代遗传的可能性提供了一个突破性的机会。如果这种遗传在树木中得到证实，它可能代表一种快速、自然的胁迫适应机制，加速森林生态系统的进化响应。然而，这种遗传在长寿树种中的程度和生态相关性在很大程度上仍未解决，需要进一步研究。
除了其诊断价值外，表观遗传学已被提议作为主动增强树木恢复力（包括对火灾相关胁迫的恢复力）的潜在工具。虽然火灾并不总是被视为独立的胁迫因子，但它会引发强烈的热量，并可能增加对后续生物和非生物挑战的易感性。关于热和防御启动的实验工作表明，先前暴露于胁迫可以诱导影响后续响应的表观遗传变化。例如，热启动涉及将胚胎或体细胞组织暴露于高温，这被称为热启动，已被证明可以产生长期的表观遗传记忆。在辐射松等物种中，这种记忆与参与染色体重组的蛋白质有关，表明热暴露可以诱导持久的表观遗传变化。这项技术为在气候胁迫下开发树木的胁迫记忆作为维持森林健康的方法打开了大门。虽然这些发现凸显了表观遗传机制对胁迫耐受性的潜在贡献，但其长期稳定性和在林业中的适用性仍有待充分证明。将表观遗传方法整合到实验研究和应用的森林管理中，最终可能支持发展更具恢复力的森林，但这将需要在物种、环境和时间尺度上进行严格的验证。
最后，为了有效地将表观遗传学纳入林业和保护实践，有几个领域需要未来的研究。未来的研究需要在破译表观遗传机制和记忆持续时间方面；这是未来实验的一个关键领域，需要更好地理解导致森林树木热胁迫记忆的复杂表观遗传机制，因为这些机制仍未完全了解。例如，尽管在胚胎发生前对海岸松进行热激的实验，产生了对热胁迫更具恢复力并保留该记忆至少2年的植物，但裸子植物在多大程度上拥有像被子植物一样的热胁迫记忆，在很大程度上仍未被探索。此外，量化单代植物表观遗传变化的速率和模式，并追踪表观遗传通量的长期趋势，以观察这些变化如何被遗传，是至关重要的。
5. 结论
在本研究中，我们发现了一个迹象，表明火灾胁迫暴露触发了地中海松的即时表观遗传时间变化，证据是在研究的相同树木中，火烧后表观遗传多态性的平均百分比从火烧前的38.34%急剧上升到火烧后的91.29%。这种分子响应包括多态性表位点、表观遗传多样性指数和私有表观遗传条带的增加，表明了对热胁迫的快速塑性调整。研究表明，正午针叶水势与表观遗传香农指数之间存在相关性，这指出了水分胁迫动态与这些表观遗传变化之间的联系。此外，初步数据表明生态响应与火线强度之间存在正相关。尽管样本量限制了明确的结论，但结果表明，在火灾事件发生后，该指数可能对火灾强度越来越敏感，值得用更大的数据集进行进一步研究。这些修饰，特别是DNA甲基化，促进了“胁迫响应”的形成，这种响应可能会在代际间持续存在，从而使长寿树木能够在不断变化的环境中适应，而无需改变其底层DNA序列。未来在识别表观遗传生物标志物和利用热启动等技术方面的研究，可以通过识别预先适应的种群和增强森林对未来气候驱动的火灾机制的恢复力，从而显著帮助保护策略。
