首次在韩国的Ostrea denselamellosa贝类中检测到头槽吸虫的分子证据：系统发育位置、组织病理学特征及季节性分布

《Aquacultural Engineering》：First molecular documentation of a bucephalid trematode in Ostrea denselamellosa (South Korea): Phylogenetic placement, histopathology, and seasonal prevalence

韩国西部海岸flat oyster中发现新型头虫科吸虫，首次通过分子-组织病理学联合作答揭示其发育阶段、病理特征及季节流行规律。采用激光显微切割技术分离寄生虫材料，基于16S和18S rDNA测序确认属新物种，病理学显示宿主消化管萎缩、性腺剥夺及组织坏死，感染率11月达67%，次年5月降至21%。为韩国贝类养殖提供病原学基础数据。

　　

陈宇|H.M.V. 乌达扬塔|龙金霞|金成贤|卡尔哈里W.A.A.H.|巴蒂格S.D.N.K.|朴京一

韩国群山国立大学海洋与生物科学学院水生生物医学系，大鹤路558号，54150群山，韩国

摘要

软体动物水产养殖在全球海鲜生产中发挥着重要作用，但日益受到寄生虫感染的挑战，例如双殖吸虫，这些寄生虫会对双壳类动物造成严重的病理和生殖影响。我们首次报道了感染韩国西海岸扁平牡蛎Ostrea denselamellosa的头部吸虫的分子证据。从2023年6月至2024年5月，我们结合使用了组织学、组织病理学和分子检测方法。通过对石蜡包埋切片进行激光显微解剖（LMD），成功分离出了用于基因组DNA提取的寄生虫材料。通过对线粒体16S和核18S rDNA的PCR扩增，并通过邻接法和最大似然法进行系统发育分析，将该寄生虫归类为Bucephalidae科。序列比对显示，其与Dollfustrema vaneyi（16S）的相似度为72.8%，与Prosorhynchoides ovatus（18S）的相似度为90.1%，表明这是一个先前未被报道的谱系，暂命名为Bucephalidae属未定种。组织学观察显示了从孢子囊到角尾蚴的多个发育阶段，以及包括消化管萎缩、生殖腺萎缩、组织坏死和血细胞浸润在内的病理变化。感染率呈现季节性波动，11月达到最高值67.0%，5月降至21.0%。这项综合性的分子-组织病理学研究扩展了人们对牡蛎中吸虫多样性的认识，并提供了必要的基础数据以及实用的LMD工作流程，以支持韩国软体动物水产养殖中的疾病诊断和监测。

引言

水产养殖是增长最快的食品生产领域之一，对粮食安全和国民经济具有重要贡献（FAO, 2022; Khormi et al., 2025）。韩国是亚洲主要的软体贝类生产国，主要生产Crassostrea gigas（太平洋牡蛎），还包括Mytilus galloprovincialis（地中海贻贝）、蛤蜊和鲍鱼（Yoo and Anderson-sprecher, 2021）。其中，扁平牡蛎Ostrea denselamellosa因其较大的体型、较高的市场价值和良好的适应性而受到越来越多的关注（Han et al., 2022; Yang et al., 2003）。

疾病仍然是软体动物水产养殖的主要限制因素。病毒、细菌、原生动物和蠕虫等病原体可导致死亡、生长受阻、繁殖中断，并造成重大经济损失（Kunselman et al., 2024; Rowley et al., 2024）。在蠕虫中，双殖吸虫尤其具有危害性，因为双壳类动物是其多宿主生命周期中的第一中间宿主；感染可导致生殖腺萎缩、组织坏死和品质下降，从而对种群产生潜在影响（Gleyce Lima de Oliveira et al., 2022; Hurtrez-Boussès et al., 2023; Lassudrie et al., 2015; Merlo, 2024）。尽管如此，韩国软体动物（尤其是牡蛎）中的吸虫感染仍缺乏详细研究。迄今为止，O. denselamellosa尚未被明确调查过双殖吸虫的感染情况，关于该宿主的物种组成、感染率、季节性和病理学的基线数据也非常有限（Chang et al., 2019; Sohn et al., 2017）。

Bucephalidae Poche, 1907是一个分布广泛的双殖吸虫科，存在于全球的海洋、咸水和淡水系统中（Madhavi and Bray, 2018; Overstreet and Curran, 2002）。该科包含约26个属和数百种已描述的物种（Louvard et al., 2025; WoRMS, 2026）；成虫寄生于硬骨鱼类，其形态特征为前端具有吻突（Bray et al., 2019; ?pakulová et al., 2002），而幼虫阶段通常会产生角尾蚴，这种角状分叉的尾部是该属名称“Bucephalus”（“牛头”）的由来，成虫有时还带有延长的触须（Kniskern, 1952; Wardle, 1990）。Bucephalidae通常遵循三宿主生命周期，以软体动物（通常是层鳃类双壳类或腹足类）作为第一中间宿主，以硬骨鱼类作为第二中间宿主和最终宿主（Louvard et al., 2025; Madhavi and Bray, 2018; Saito et al., 2025; Smirnov and Gonchar, 2023）。主要属包括Bucephalus、Prosorhynchoides、Rhipidocotyle和Dollfustrema（Atopkin et al., 2022）。据我们所知，Bucephalidae在韩国的O. denselamellosa中的感染情况尚未被记录，因此激发了本次研究。

激光显微解剖（LMD）能够从组织切片中精确分离出特定区域，获得高纯度的材料用于后续分子分析，同时将周围宿主组织的污染降到最低（DeCarlo et al., 2011）。该技术广泛应用于肿瘤学、神经科学、发育生物学和法医学，并在寄生虫学领域得到广泛应用，因为它可以保存微小或嵌入目标中的核酸和蛋白质（Chung and Shen, 2015; Ellis et al., 2021; Franco et al., 2010; Jones et al., 2004; Schaeck et al., 2016; Small et al., 2008）。在自然感染的海洋双壳类动物中，双殖吸虫的孢子囊通常很小，深埋在宿主组织中，且感染强度较低，这限制了完整寄生虫的回收用于形态学检查，并使得从宿主组织中提取大量DNA时容易受到宿主DNA的污染。在这种情况下，LMD能够直接从组织切片中选择性地分离出经组织学确认的寄生虫结构，从而实现对其他无法获取的寄生虫阶段的精确分子鉴定。因此，在本研究中，我们使用LMD从牡蛎组织切片中选择性地分离出寄生虫材料，为后续的分子鉴定和系统发育分析奠定了基础。

在本研究中，我们报道了感染韩国西海岸Gaeyado（意为“Gaeya岛”）地区O. denselamellosa的头部吸虫，并提供了结合组织学和LMD技术的分子分析的综合报告。具体来说，我们记录了寄生虫的组织分布和病理变化，使用新的扩增子引物集生成了线粒体16S和核18S rDNA序列，确定了其系统发育位置，并量化了一年内野生牡蛎中的月感染率。通过将LMD与遗传标记结合使用，本研究提供了一种可用于疾病诊断和长期监测的工作流程，对维护牡蛎健康和区域水产养殖的韧性具有直接意义。

研究区域和样本采集

野生扁平牡蛎（O. denselamellosa）采集自韩国西海岸的Gaeyado（图1）。最初，在2023年6月获得了5只成年牡蛎用于初步组织学观察。随后，从2023年6月到2024年5月，共采集了239只牡蛎（壳长：83.13±12.89毫米，平均值±标准差），每月样本数量根据可用性在15到30只之间变化（补充表1）。

头部吸虫的组织学检测和发育阶段

苏木精和伊红（H&E）染色的切片显示O. denselamellosa中头部吸虫的多个发育阶段（图3）。在结缔组织中，常见孢子囊簇（图3A）。在高倍显微镜下，孢子囊内含有许多胚球（星号标记），大小范围约为6.99至44.09微米（图3B）。早期尾蚴（c）与胚球存在于同一孢子囊内（图3C）。随着进一步发育，角尾蚴显示出明显的分叉特征

讨论

据我们所知，本研究首次报道了感染韩国西海岸扁平牡蛎O. denselamellosa的头部吸虫的分子证据。通过结合组织学和激光显微解剖技术对线粒体16S及核18S rDNA进行测序，我们鉴定出一个暂命名为Bucephalidae属未定种的谱系。这一发现填补了韩国牡蛎研究中的一个重要空白，特别是关于双殖吸虫感染的方面

结论

据我们所知，本研究首次提供了感染扁平牡蛎O. denselamellosa的头部吸虫的分子和组织病理学证据。通过使用激光显微解剖技术从石蜡包埋切片中取样、目标PCR以及线粒体16S和核18S rDNA的系统发育分析，我们证明该寄生虫属于Bucephalidae科的一个独立谱系。病理变化包括消化管萎缩、生殖腺萎缩等

CRediT作者贡献声明

陈宇：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿。H.M.V. 乌达扬塔：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，概念构思。龙金霞：方法学。金成贤：方法学。卡尔哈里W.A.A.H.：方法学。巴蒂格S.D.N.K.：撰写 – 审稿与编辑。朴京一：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，项目管理，资金获取，概念构思。

资助

本研究得到了韩国海洋科学技术促进院（KIMST）的支持，资金来自韩国海洋渔业部 [RS-2022-KS221679]。

未引用参考文献

Ceuta and Boehs, 2012

利益冲突声明

本手稿的提交不存在利益冲突，所有作者均同意发表。