《Aquaculture Reports》：Identification and characterization of a new strain of
Micropterus salmoides rhabdovirus (MSRV-Bces-Ts23) isolated from greenfin horse-faced filefish (
Thamnaconus modestus) in China
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本研究聚焦于水产养殖中病毒病的严重威胁，首次报道了从患病海水鱼类绿鳍马面鲀中分离到一株新型大口黑鲈弹状病毒（MSRV-Bces-Ts23），完成了其基因组测序、生物学特性与致病性分析，并建立了针对G基因的qPCR检测方法与鉴定出14个潜在B细胞表位。该发现首次证实MSRV可跨宿主感染海水鱼，揭示了其宿主范围扩展的潜在风险，为相关病毒的监测、检测与免疫防控提供了关键依据，对保障水产养殖生物安全具有重要意义。
在水产养殖业蓬勃发展的背后，病毒病的阴影始终挥之不去，它们能导致养殖鱼类大规模死亡，造成巨大的经济损失。大口黑鲈弹状病毒（Micropterus salmoides rhabdovirus, MSRV）就是这样一个令人头疼的“刺客”。自2011年在中国广东的淡水大口黑鲈（俗称加州鲈）鱼苗中首次被发现以来，它便被认定为对该鱼种养殖威胁最大的病原体之一，主要感染体长3-5厘米的幼鱼，致死率超过80%。受感染的鱼会出现身体畸形、螺旋式或侧身平游、肝脏和脾脏肿大等症状。然而，科学界一直认为MSRV是淡水鱼的“专属杀手”，在海水鱼中感染的情况从未被报道过。
与此同时，另一种具有高经济价值的鱼类——绿鳍马面鲀（Thamnaconus modestus），作为一种重要的海水养殖品种，其产业规模正在不断扩大。此前，在这种鱼身上只发现过细菌性和寄生虫性疾病，病毒性疾病是一片空白。2023年5月，在中国水产科学研究院北戴河中心实验站的育苗车间里，大量体长约4厘米的绿鳍马面鲀鱼苗不明原因死亡，但病鱼体表和内脏均未观察到明显的病变迹象。这起神秘的死亡事件背后，究竟隐藏着怎样的病原体？它是否意味着我们已知的病毒正在悄然突破宿主的界限？
为了揭开谜底，一支由中国水产科学研究院水生基因组学重点实验室的研究人员领衔的团队展开了调查。他们的研究成功地首次从海水鱼——绿鳍马面鲀中分离并鉴定出一株新型MSRV毒株，并将其命名为MSRV-Bces-Ts23。这项突破性的研究成果发表在《Aquaculture Reports》上，不仅填补了该病毒在海水鱼感染领域的知识空白，更向我们敲响了警钟：病毒的宿主范围可能比我们想象的更广，跨环境传播的风险真实存在。
研究人员运用了多种现代生物学技术来解构这个新发现的病毒。首先，他们从患病鱼体组织中分离病原，利用牙鲆鳍细胞系（FIN）进行病毒培养，并通过透射电子显微镜（Transmission Electron Microscopy, TEM）直接观察到了病毒颗粒典型的子弹状形态。为了精准鉴定病毒身份，他们采用了逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）、基于小RNA测序的病毒组学（Virome）分析以及全基因组测序与组装。通过设计多对引物进行PCR扩增和末端快速扩增（RACE），他们成功拼接出了该病毒完整的基因组序列。此外，研究还建立了针对病毒糖蛋白（Glycoprotein, G）基因的绝对定量实时荧光定量PCR（qPCR）检测方法，用于精准量化病毒载量。为了探究病毒的致病性，他们对健康的绿鳍马面鲀进行了人工腹腔注射感染实验，并通过组织病理学（HE）染色和透射电镜观察感染后的组织病变。最后，他们还利用生物信息学工具预测了病毒G蛋白的B细胞线性抗原表位，为未来的疫苗或抗体开发提供了靶点。
研究结果揭示了以下关键发现：
3.1. 患病绿鳍马面鲀的临床症状
患病鱼表现为高死亡率，但体表（皮肤和鳍）及解剖后的内脏均未观察到明显的红斑、肿胀、溃疡或出血等病变。这表明该病毒感染可能引发不典型的、隐性的临床症状。
3.2. 病毒分离与毒力评估
排除了寄生虫和细菌为主要死因后，用病鱼组织匀浆感染FIN细胞，在第7天观察到明显的致细胞病变效应（Cytopathic Effect, CPE）。透射电镜观察显示，病毒颗粒聚集在感染细胞表面，呈非典型子弹状，长度约200-300纳米，宽度约80-120纳米。
3.3. 病毒鉴定
小RNA测序结果显示，序列与MSRV相似度最高。使用MSRV特异性引物进行PCR，能从病鱼匀浆中扩增出特异性条带，测序结果与已知MSRV株系序列相似性达100%，证实病原为MSRV。
3.4. 全病毒基因组测序分析
新毒株MSRV-Bces-Ts23的全基因组长度为11，567个碱基对（bp），编码五个典型的结构蛋白：核蛋白（N）、磷蛋白（P）、基质蛋白（M）、糖蛋白（G）和RNA聚合酶大蛋白（L）。与已报道的五个MSRV株系相比，全基因组序列相似性在96.93%到99.03%之间。其中，与MSRV-HZ01相似性最高，但在G蛋白氨基酸序列上存在7个位点突变。
3.5. MSRV-Bces-Ts23的系统发育分析
系统进化树显示，MSRV-Bces-Ts23与MSRV-HZ01亲缘关系最近，并与所有已知MSRV分离株共同聚集在Siniperhavirus属的一个分支内，从遗传学上确认了其MSRV的身份。
3.6. MSRV-Bces-Ts23-G的标准曲线
成功构建了针对G基因的绝对定量qPCR标准曲线，线性回归方程为y = -3.9876x + 45.666，相关系数R2= 0.9991。该方法可用于高灵敏度、高特异性地检测病毒。
3.7. 实验感染
对绿鳍马面鲀进行腹腔人工感染实验，感染组14天后的存活率为36.11%，而对照组为100%，差异显著。qPCR检测发现，病毒主要存在于病鱼的脑组织中，平均载量达1×106.3拷贝/微克RNA，而在脾和肾中含量极低。组织病理学观察发现，感染鱼脑部网状结构收缩，与脑室周围灰质区连接疏松。透射电镜进一步在脑组织细胞膜和细胞质内观察到了病毒颗粒及细胞空泡变性等病变。这表明MSRV-Bces-Ts23能够穿越血脑屏障，感染并损伤绿鳍马面鲀的中枢神经系统，这可能是导致其死亡的关键原因。
3.8. MSRV-Bces-Ts23-G肽抗原表位的鉴定
通过生物信息学分析，预测了MSRV G蛋白的二级结构、跨膜区，并鉴定出14个潜在的B细胞线性抗原表位，这些表位序列为未来开发特异性诊断试剂或亚单位疫苗提供了重要的候选靶点。
研究结论与讨论部分强调了此项工作的深远意义。 本研究首次分离并系统表征了感染海水鱼绿鳍马面鲀的MSRV新毒株MSRV-Bces-Ts23。这一发现从根本上改变了我们对MSRV宿主特异性的认知，证明这种原先被认为专性感染淡水大口黑鲈的病毒，其宿主范围已扩展至海水鱼类。尽管其在基因组水平上与已知MSRV株系高度相似，但感染海水鱼后并未表现出在淡水鲈鱼中常见的典型外部症状（如螺旋游动），而是更隐秘地攻击脑组织，这提示病毒在不同宿主中的致病机制可能存在差异。
研究团队在讨论中提出了几个关键的科学问题与展望。首先，病毒G、N、P蛋白上发现的氨基酸突变，是否与其获得感染海水鱼的能力有关？G蛋白是介导病毒入侵细胞的关键蛋白，其变化可能与宿主范围扩展、毒力改变或免疫逃逸相关。其次，MSRV作为一种原本在淡水环境中传播的病毒，是如何在海水环境中存活并实现传播的？盐度是否影响其稳定性和传染性？这提示我们需要关注水源、饵料生物（如轮虫）等可能成为病毒跨环境传播的载体。最后，该病毒能够穿越血脑屏障感染脑组织的机制，也是未来需要深入研究的重点。
综上所述，MSRV-Bces-Ts23的发现是一个重要的预警信号。它表明水产养殖中的病毒威胁并非一成不变，病原体可能通过进化适应新的宿主和环境。这项研究不仅为MSRV的检测提供了精准的qPCR方法，为其免疫防控揭示了潜在的抗原表位靶点，更重要的是，它呼吁整个水产养殖行业、监管部门和科研机构必须提高警惕，加强对多种养殖鱼类的广泛监测，并采取积极的预防措施，以应对病毒宿主范围扩大所带来的潜在风险，保障水产养殖业的可持续和健康发展。
