《Biochemical Engineering Journal》：Methodological Framework for Fused Filament Fabrication of 3D-Printed Beads for Cell Immobilization in Bioprocesses
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本研究提出一种基于熔融沉积成型（FFF）的3D打印聚合物微珠制造新方法，结合ABS和PLA材料，实现定制化多孔结构设计。该技术克服传统固定化材料机械强度低、结构单一等缺陷，在保持高重复性和尺寸精度的同时，显著提升细胞固定化效率及传质效率，为生物工程中可扩展、低成本的固定化技术提供创新解决方案。
Ricardo Gonzalo Ramírez Brenes|Rubén Ruiz Simón|Isabella Maria Tenório Soares Santos|Victoria E. Santos Mazorra|Ninoska Bojorge Ramírez|Nei Pereira
里约热内卢联邦大学化学学院，Av. Athos da Silveira Ramos 149，Ilha do Fund?o 21941-972，巴西
摘要
本研究提出了一种创新的方法，通过3D打印技术制造聚合物珠子，以增强生物工艺工程中的细胞固定策略。利用熔融丝材制造（FFF）技术，制备了由丙烯腈-丁二烯-苯乙烯（ABS）和聚乳酸（PLA）组成的珠子，这些珠子具有精确设计的几何形状，从而能够系统地评估材料类型和内部结构对制造可行性和结构稳定性的影响。该方法表现出高重复性、尺寸精度和灵活性，使研究人员能够根据特定的生物工艺条件制造出合适的固定珠子。与传统固定基质相比，这种基于FFF的方法提供了一种可扩展、成本效益高且可定制的替代方案，能够生产出促进微生物附着和物质传递的复杂多孔结构。该方法不仅限于酶的固定，还扩展了增材制造的应用范围，为未来的生物技术工艺开发提供了有价值的框架。
引言
细胞固定对于提高生物工艺工程的稳定性和简化下游过程至关重要[1]、[2]。传统方法（如水凝胶包封或吸附）往往难以实现足够的机械强度和对内部几何形状的精确控制。例如，在有机酸发酵中，固定的细胞在八个循环内能够持续稳定地产生乳酸，且没有生产力损失[3]、[4]。因此，对能够承受生物反应器流体动力应力的坚固、可定制的支撑材料的需求日益增加[5]。在环境生物技术中，使用固定的生物催化剂可提高污染物去除率21-60%，某些系统甚至实现了几乎完全的修复[6]、[7]、[8]、[9]。除了这些应用之外，细胞固定还在药物合成和生物传感中显示出重要作用，能够延长催化剂的寿命、提高重复性和长期稳定性[10]、[11]、[12]。
已经开发出多种细胞固定策略和支撑材料，以满足各种生物工艺的具体需求。细胞可以通过表面粘附[13]、[14]、被包裹在水凝胶（如海藻酸盐、琼脂糖或聚丙烯酰胺）[15]、[16]中，或者通过保留膜进行物理分离[17]、[18]、[19]来实现固定。与固体珠子的共价结合可以提供更好的稳定性，但根据所涉及的化学性质可能会影响细胞的存活率[14]、[20]。天然材料（如海藻酸盐、壳聚糖、胶原蛋白和琼脂糖）因其生物相容性而被广泛使用[21]、[22]、[23]。相比之下，合成聚合物（包括PDMS（聚二甲基硅氧烷）、基于PEG（聚乙二醇）的水凝胶、聚氨酯、PVA（聚乙烯醇）、PLA（聚乳酸）、PCL（聚己内酯）和ABS（丙烯腈-丁二烯-苯乙烯）具有可调的机械和物理化学性质，具有更优的工业适用性[14]、[24]、[25]、[26]。
尽管这些传统基质被广泛使用，但它们仍面临一些挑战，包括机械稳定性差、长时间运行后降解以及孔隙率和几何形状控制有限[27]、[28]。这些限制限制了在高剪切环境下的定制程度，因此人们开始关注能够生产出更坚固基质的制造策略。在这种情况下，增材制造（AM），特别是熔融丝材制造（FFF），可以生产出具有定制结构的复杂支架。虽然FFF在酶固定和组织工程中得到了广泛应用，但其在全细胞生物催化中的应用仍然不足[29]、[30]、[31]。因此，现有文献缺乏将3D打印参数转化为微生物系统中可重复固定性能的标准协议。高层次方法参数与特定设备配置之间的区别往往加剧了这一技术差距。本研究中进行的实验优化确立了这种区别，并在表S1中进行了总结。
增材制造的最新进展，例如用于智能检测的超微流体微针（MMM）的发展[32]，展示了将高精度几何形状与功能性生物界面结合的潜力。受这些发展的启发，本研究建立了一个框架，以弥合数字设计与全细胞固定之间的差距。
越来越多的证据表明，打印技术和材料选择对固定效果有重要影响。Ramírez Brenes等人（2025年）报告称，具有六边形孔结构的ABS珠子的细胞固定率达到84.7%，优于PLA，因为其表面粗糙度更高[30]。其他使用DIW（直接墨水书写）纳米纤维素支架的研究显示，酶的固定效率为18-37%[33]。通过DIW或SLA（立体光刻）制造的水凝胶在固定条件较为温和的情况下也表现出物质传递的限制[34]、[35]。长期性能也因材料而异：PLA支架在20天后仍保留约80%的酶活性[36]，而VPP（槽光聚合）陶瓷结构的生产力提高了八倍[37]。这些比较研究强调了聚合物珠子的灵活性和耐用性。陶瓷支撑材料能最大化生产力，而水凝胶基质则有利于温和的固定。这表明需要一种平衡的设计策略。然而，几乎所有这些进展都集中在酶系统上。因此，尽管细胞固定在其发酵、生物修复和工业氧化生物工艺中具有基础性重要性，但相关研究仍然相对较少[10]、[11]、[12]。尽管酶固定由于其简单性和坚固性而在工业生物技术中占主导地位[38]、[39]、[40]，但当需要整个生物体的代谢网络时，细胞固定仍然是必不可少的[6]、[41]。因此，推进细胞固定技术——特别是通过可定制的3D打印珠子——代表了生物工艺工程中的一个重要创新机会。FFF技术能够制造出具有定制孔隙网络、可控表面形态和增强机械抗性的载体，解决了传统基质的长期局限性。使用ABS和PLA等易于获取的热塑性塑料进行打印的能力，提供了低成本、定制几何形状和工业坚固性的独特组合，这使得该方法特别适用于可扩展的生物工艺。
这些比较研究突显了通过增材制造制造的聚合物珠子的灵活性和耐用性。尽管有关3D打印全细胞固定的报道不断出现，但仍然存在显著不足：缺乏详细、全面且完全可重复的制备协议，这限制了这些载体在生物工艺实验室中的广泛应用。本研究直接解决了这一方法论缺陷。我们提出了一种全面的、可重复的方法，用于通过FFF制造3D打印固定珠子。所建立的协议涵盖了从切片参数到打印、后处理和表面功能化的每一个关键步骤，使得该技术可以在不同的微生物系统中精确复制和调整。通过建立这一方法论基础，本研究旨在将FFF的应用范围从酶固定扩展到全细胞生物催化剂系统，从而促进材料工程原理在先进、可扩展的生物工艺开发中的应用。
材料与微生物
3D打印实验使用的是GTMax3D GT4打印机（GTMax3D Electron Equipment and Plastic Materials Ltd，巴西圣保罗）。打印材料为PLA丝材（Esun Filaments Industrial Co., Ltd.，中国深圳）和ABS丝材（GTMax3D Electron Equipment and Plastic Materials Ltd，巴西圣保罗），数据传输使用标准SD存储卡。珠子的设计和建模是在TinkerCAD（Autodesk, Inc.，美国加利福尼亚）中完成的。
珠子尺寸和结构的定制
熔融丝材制造（FFF）3D打印在制备细胞固定珠子方面具有显著的多功能性，可以精确控制尺寸以满足特定的实验和反应器要求。珠子尺寸可以调整，以保持珠子与反应器直径之间的比例关系。较大的珠子可能更适合某些固定床或填充柱配置。相比之下，较小的珠子——理想情况下是反应器柱直径的10-20倍——可以结论
总之，本研究建立了一个基于FFF的3D打印固定珠子的稳健方法论框架，弥合了数字设计与生物工艺应用之间的差距。除了验证的参数之外，未来的研究应转向使用生成设计算法来创建数学优化的孔结构，例如三周期最小表面（TPMS）。这种结构可以显著减少扩散死区并提高营养物质的传递效率
资助
第一作者感谢里约热内卢研究基金会（FAPERJ）通过授权号E-26/202.323/2024以及高等教育人员培训协调委员会（CAPES）通过授权号88881.126057/2025-01提供的财政支持。
作者还感谢国家工业生物技术科学技术研究所（INCT-Bio）的支持，该研究所由CNPq资助（项目编号406375/2022-4）。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
我们感谢里约热内卢联邦大学COPPE电子显微镜中心在显微镜使用方面提供的支持。
机构审查委员会声明
不适用。
知情同意声明
不适用。
