具有可调机械性能的海藻酸/明胶水凝胶的3D生物打印技术，用于骨骼肌再生

《Biomaterials Advances》：3D bioprinting of alginate/gelatin hydrogels with tunable mechanical properties for skeletal muscle regeneration

开发了一种基于离子交联和动态凝胶的Alg/Gel双网络水凝胶，通过调节Gel比例实现力学性能的梯度调控（压缩模量14.8-23.7 kPa，拉伸强度194 kPa）。该水凝胶作为生物墨水在3D生物打印中成功构建稳定的多孔肌组织结构，支持C2C12肌细胞的高存活率（>90%）、增殖及分化（MyoD/MyoG表达增强），揭示了微孔结构和力学特性对肌原细胞分化的调控作用。

　　

Kapil D. Patel | Mark R. Shannon | Adam W. Periman

澳大利亚国立大学约翰·柯廷医学研究学院（JCSMR），堪培拉，ACT，澳大利亚

摘要

机械可调的双网络（DN）水凝胶正成为软组织工程中多功能生物材料，但精确控制其结构和力学性能仍然具有挑战性。在这里，我们开发了由海藻酸盐（Alg）和明胶（Gel）组成的软离子交联双网络水凝胶，用于三维（3D）骨骼肌组织工程。钙离子（Ca²⁺）对海藻酸盐的交联作用生成了被包裹的明胶微相，从而产生了具有互连微孔结构的机械增强型水凝胶。制备了三种不同比例的海藻酸盐/明胶混合物（Alg:Gel = 1:0、1:0.25 和 1:0.50 w/w），其中明胶含量的增加显著改变了水凝胶的性质。压缩模量从 14.8 kPa 增加到 23.7 kPa，而 Alg:Gel (1:0.25) 配方的抗拉强度最高，达到 194 kPa。储能模量（G'）和损耗模量（G"）也随着明胶含量的增加而增加，分别为 43.5 kPa（G'）和 9.6 kPa（G"）。所开发的海藻酸盐/明胶水凝胶被用作3D生物打印的生物墨水，能够制造出形状保真度高的机械稳定3D复杂结构。封装在3D生物打印海藻酸盐/明胶水凝胶中的C2C12肌母细胞表现出强烈的代谢活性、高细胞存活率（>90%）以及增强的增殖能力。此外，海藻酸盐/明胶水凝胶还促进了MyoD、MyoG和肌球蛋白重链（MYH）的表达，促进了有效的肌生成分化和多核肌管的形成。综上所述，可调的力学性能、微孔性、粘弹性松弛以及明胶介导的生物活性使得海藻酸盐/明胶双网络水凝胶成为3D生物打印骨骼肌再生的有前景的生物墨水平台。

引言

细胞通常存在于一个复杂的三维（3D）微环境中，该环境包含蛋白聚糖、蛋白酶、胶原蛋白和生长因子，这些成分会随着细胞外基质（ECM）的重塑而不断变化 [1]，[2]。这些动态的细胞-ECM相互作用对细胞命运和随后的组织稳态起着关键作用。已经设计了多种合成策略来制造生物材料，以模仿天然ECM的独特性质 [3]，[4]，[5]，[6]。然而，生成天然ECM的动态力学性能以及基于复杂结构的营养扩散特性仍然是一个挑战。

骨骼肌在体积损伤后的再生需要能够复制天然ECM关键特性的支架，如机械顺应性、粘弹性、应力松弛和多孔结构。水凝胶已被广泛研究作为在体外和体内应用中维持3D干细胞培养的生物相容性材料 [7]，[8]，[9]，[10]。然而，水凝胶往往缺乏这种精细的组合，限制了它们支持肌母细胞排列、融合和成熟为功能性肌管的能力。组织机械生物学的最新进展表明，不仅弹性模量，而且时间依赖的力学行为（如应力松弛）和微结构孔隙性也对细胞扩散、牵引力生成和谱系定向有重要影响 [11]，[12]，[13]，[14]。因此，肌生成分化不仅受化学因素驱动，还受到周围微物理性质的深刻调节。

最近，离子交联或双交联双网络（DN）水凝胶的动态键合特性在组织工程中的应用得到了广泛研究 [8]，[15]，[16]。在这些系统中，明胶（Gel）是一个理想的成分，因为它可以通过温度轻松交联，为细胞粘附、增殖和分化提供生物相容性的微环境。例如，已经开发并研究了明胶/海藻酸盐、明胶/纤维蛋白、明胶/胶原蛋白、明胶/丝素纤维蛋白、明胶/透明质酸以及各种其他天然蛋白质组合在组织工程中的应用 [17]。然而，许多这类水凝胶的局限性在于制备后的不稳定性，例如，3D生物打印结构在37°C的细胞培养基中可能会坍塌 [18]。此外，已经开发了几种方法来创建用于3D生物打印结构中的稳定明胶基水凝胶。其中，添加海藻酸盐（Alg）——一种具有良好生物降解性、兼容性和亲水性的天然聚合物——已被用来稳定水凝胶 [19]，[20]，[21]，[22]。这一过程通过二价阳离子螯合作用实现，并调节了所得水凝胶的键合强度，从而影响其力学性能 [23]。例如，Giuseppe等人研究了九种不同比例的海藻酸盐/明胶水凝胶的力学性能，以确定最佳的可打印性、机械强度和细胞存活率 [24]。Sonaye等人开发了基于海藻酸盐/明胶的生物墨水用于3D生物打印，以解决体积肌肉损失（VML）问题，并实现了最佳的可打印性、结构保真度和细胞增殖，但缺乏详细的体外细胞分析 [25]。

鉴于水凝胶硬度在细胞调控中的关键作用，具有可变硬度的3D生物可打印明胶/海藻酸盐（Gel/Alg）水凝胶已被广泛研究 [21]，[26]。例如，Samp等人证明，在水性软明胶水凝胶中加入少量海藻酸盐可以增强复合材料的韧性，而不显著改变压缩模量，为软组织再生提供了一个潜在平台 [27]。Cadamuro等人通过静态-动态交联开发了一种基于海藻酸盐/明胶的自修复水凝胶，以模拟ECM，用于软组织修复和再生 [20]。Gao等人通过分析流变参数（包括储能模量（G'）和损耗模量（G"）来研究海藻酸盐/明胶水凝胶的3D可打印性，以评估挤出性能、挤出均匀性和结构完整性，但没有对3D打印结构进行细胞研究 [28]。Distler等人使用氧化海藻酸盐/明胶（ADA/Gel）基DN生物墨水与C2C12细胞进行生物打印，探讨了基质稳定性和细胞增殖、基质重塑以及肌生成分化能力 [29]。他们证明，优化喷嘴直径和挤出压力可以诱导细胞定向；然而，他们的研究仅限于单一生物墨水配方，限制了更广泛的成分洞察。

在这里，我们设计了海藻酸盐/明胶双网络水凝胶，其中Ca²⁺交联的海藻酸盐框架包含一个动态的明胶微相，从而能够协调调节孔结构、粘弹性松弛和力学性能。我们假设系统地调节海藻酸盐/明胶网络性能将揭示微结构和力学线索如何调控3D结构中的肌母细胞行为。为此，我们制备了不同比例（1:0、1:0.25 和 1:0.50）的海藻酸盐/明胶水凝胶，并分别使用Cryo-SEM、机械测试和流变测试量化了其微结构、拉伸和压缩性能以及粘弹性行为。此外，这些配方被用作基于挤出的3D生物打印的生物墨水，与C2C12肌母细胞一起使用，并评估了它们在3D打印结构中支持代谢活性、细胞存活率和增殖的能力。最终，3D打印结构的分析揭示了DN基质组成变化如何调控肌生成，并确定了用于制造骨骼肌组织的优化海藻酸盐/明胶生物墨水。

材料

商业牛明胶（来自B型牛皮，G9391，Bloom约225；Sigma-Aldrich，美国），海藻酸盐（Sigma-Aldrich，德国），氯化钙二水合物（CaCl₂.2H₂O，Sigma-Aldrich，中国）。所有化学品均按接收状态使用，无需进一步纯化。

海藻酸盐/明胶水凝胶的制备

将7.5 wt%的明胶溶解在37°C的去离子水（DW）中2小时。在DW中制备了类似凝胶的海藻酸盐（7.5 wt%）溶液，并使用双不对称离心机（DAC 150.1 FVZ，Speedmixer，德国）以3500 rpm的速度进行均质化

海藻酸盐/明胶水凝胶的合成与表征

海藻酸盐/明胶双网络水凝胶是通过在40°C下混合两种聚合物溶液并在室温下用CaCl₂进行交联而制备的（图1）。这形成了一个双网络结构，其中海藻酸盐多糖链与二价钙离子（Ca²⁺离子交联，明胶相通过氢键连接。海藻酸盐的质量分数固定为7.5 wt%，明胶含量分别变化为1.875 wt%和3.25 wt%，得到Alg:Gel比例为1:0.25和1:0.50。

结论

在这项研究中，我们解决了开发一种机械可调且生物支持性的水凝胶的挑战，这种水凝胶适用于骨骼肌组织的3D生物打印。通过将明胶整合到离子交联的海藻酸盐网络中，我们创造了既能提供结构稳定性又能实现肌生成生物功能性的双网络水凝胶——这是生物墨水中常常缺乏的两个关键要求。此外，通过系统地改变海藻酸盐/明胶的组成，我们找到了合适的

CRediT作者贡献声明

Kapil D. Patel：撰写——原始草稿，可视化，验证，调查，数据管理，概念化。Mark R. Shannon：验证，软件。Adam W. Periman：撰写——审阅与编辑，监督。

利益冲突声明

作者声明他们没有财务利益或个人利益冲突。

致谢

作者感谢工程与物理科学研究委员会（EPSRC）和UK的emPOWER项目对布里斯托大学的支持，资助编号为EP/T020792/1。作者还感谢布里斯托大学的Wolfson生物成像设施在CLSM和FE-SEM成像方面的支持和帮助。作者还要感谢澳大利亚国立大学的先进显微镜中心（CAM）的支持