《Microbiology Research》：Molecular Biodiversity and De Novo Transcriptomic Analysis of Boletus griseipurpureus: Investigating Associated Genes During Symbiosis with Specific Hosts
Alisa Nakkaew and
Kotchakorn Praopring
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本项研究聚焦禽腺病毒血清4型(FAdV-4)所致的心包积水-肝炎综合征(HHS)防控，开发了一种基于重组六邻体-L1(hexon-L1)与纤维蛋白-2(fiber-2)抗原的双价亚单位疫苗。研究证实，20 μg剂量可在无特定病原体(SPF)雏鸡中诱导强烈的剂量依赖性体液免疫应答，实现攻毒后100%存活率，并完全抑制组织病变、病毒播散与排毒，为防控HHS提供了一种安全有效的新型疫苗策略。
引言：FAdV-4的流行病学、经济影响与疫苗开发靶点
禽腺病毒血清4型(FAdV-4)是禽腺病毒属(Aviadenovirus)成员，也是导致心包积水-肝炎综合征(HHS)的主要病原体，给全球家禽业造成严重经济损失。近年来出现的超强毒力毒株（如SDLC202009）与高死亡率相关。FAdV-4的结构蛋白中，六邻体(hexon)和纤维蛋白-2(fiber-2)是关键的抗原靶点。六邻体-L1环含有型特异性中和表位，而fiber-2是关键毒力决定因子，并能激发强效的中和抗体反应。尽管现有灭活疫苗和弱毒活疫苗有一定效果，但仍存在保护不完全、生物安全风险等问题。因此，开发基于主要抗原的亚单位疫苗成为一种更安全、更精准的策略。本研究旨在构建并评估一种包含hexon-L1和fiber-2的双价亚单位疫苗，以对抗同源高致病性FAdV-4的攻击。
材料与方法：疫苗构建、动物实验与全面评估体系
研究以高致病性FAdV-4毒株SDLC202009（GenBank: OP484855）为模板，通过PCR扩增获得hexon-L1和fiber-2基因，并将其克隆至pET-32a(+)表达载体，转化至大肠杆菌(E. coli) Rosetta(DE3)中进行表达。重组蛋白在优化条件（37°C，IPTG诱导）下表达，通过镍柱亲和层析在天然条件下纯化，获得分子量约为43.23 kDa的hexon-L1蛋白和70.51 kDa的fiber-2蛋白，纯度超过90%。
将纯化的两种蛋白按1:1质量比混合，配制成水包油型双价亚单位疫苗。疫苗进行了无菌和稳定性测试，符合要求。
动物实验使用30只7日龄SPF雏鸡，随机分为3组（每组10只）：10 μg抗原剂量组、20 μg抗原剂量组和生理盐水对照组。通过腿部肌肉注射进行初次免疫，14天后加强免疫，再14天后，用同源强毒株SDLC202009（约104.67EID50）进行攻毒。随后进行为期14天的观察，评估指标包括：
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生存率：记录每日死亡情况。
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病理变化：对死亡鸡和攻毒后14天存活的鸡进行剖检，根据标准对心脏、肝脏、脾脏、肾脏等器官的病变进行评分（0-10分）。
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组织病理学与免疫组化：取心、肝、肾、胰等组织，进行H&E染色和针对FAdV-4抗原的免疫组化染色，评估组织损伤和病毒抗原分布。
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病毒分布：采集脑、心、肺、肝、肾、胰等组织，提取DNA后进行PCR检测，分析病毒在器官中的存在情况。
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病毒排毒：在攻毒后第3、5、7、14天，采集泄殖腔和口腔拭子，进行PCR检测，评估病毒排毒动态。
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抗体反应：在免疫前、一免后、二免后采集血清，使用ELISA试剂盒检测血清抗体滴度。
研究设立了严格的对照体系，包括空白载体对照、非诱导表达对照、佐剂对照、攻毒阳性对照（盐水组）以及各项检测的阴/阳性对照，以确保结果的特异性和可靠性。
结果：双价疫苗展现剂量依赖性的全面保护
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生存保护：攻毒后，对照组鸡在5天内全部死亡（死亡率100%）。而10 μg和20 μg疫苗免疫组在整个14天观察期内均实现100%存活。
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病理损伤减轻：剖检显示，对照组出现典型HHS病变：心包积液、肝脏黄肿出血、肾脏肿大花斑。免疫组病变显著减轻，20 μg组病变最轻微。平均病变评分显示，免疫组各器官评分均显著低于对照组，且20 μg组低于10 μg组。
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组织学与病毒抗原清除：组织学上，对照组可见心肌水肿、肝细胞空泡变性坏死伴核内包涵体、肾小管上皮坏死。免疫组病变程度和范围显著降低。免疫组化结果显示，对照组肝、肾、胰中病毒抗原广泛分布；10 μg组仅在部分鸡的肝和胰中检测到零星弱阳性；20 μg组在所有检测器官中均未检出病毒抗原。
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病毒组织分布抑制：PCR检测显示，病毒DNA存在于对照组所有被检器官中。10 μg组仅在60%的胰腺样本中检测到病毒DNA，而20 μg组在所有被检器官中均未检测到病毒DNA。
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病毒排毒阻断：对照组从攻毒后第3天开始持续排毒。10 μg组在第3、5天有部分排毒，第7天后停止。20 μg组在攻毒后所有时间点均未检测到病毒排毒。
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体液免疫应答：ELISA检测显示，免疫前各组抗体水平相近。一免后，免疫组抗体滴度上升，20 μg组高于10 μg组。二免后，抗体滴度进一步显著升高，20 μg组达到44 ng/mL，呈现明显的剂量依赖性。
讨论与结论：安全有效的疫苗策略及其展望
本研究成功构建并评价了针对FAdV-4的hexon-L1/fiber-2双价亚单位疫苗。结果表明，该疫苗，特别是20 μg剂量，能激发强大的剂量依赖性体液免疫，在同源攻毒中提供完全保护，表现为：100%存活、显著减轻甚至消除组织病理损伤、有效清除器官中的病毒抗原和DNA、完全阻断病毒向环境中的排毒。这些结果验证了该双价策略的可行性，为防控HHS提供了一种具有前景的安全、有效的新型亚单位疫苗候选。
研究同时指出了几点局限性：样本量较小；未设置单独的fiber-2单价疫苗对照组，因此无法评估hexon-L1的加入是否带来额外增益；保护效果仅针对同源毒株进行了验证；未检测中和抗体滴度；未评估长期免疫力。
未来研究需扩大样本量，设立fiber-2和hexon-L1单价疫苗对照以明确各抗原贡献，评估对异源毒株的交叉保护力，检测中和抗体，并探索细胞免疫机制。尽管存在局限，但该疫苗，尤其是其完全阻止病毒排毒的特性，对于降低农场内病毒传播风险具有重要意义，为后续开发更优的FAdV-4防控产品奠定了坚实的实验基础。
