综述：用于人类的工程微生物的生物防护策略的进展

《Current Opinion in Microbiology》：Advances in biocontainment strategies of engineered microbes for use in humans

基因工程微生物在医学应用中的生物安全策略研究，包括毒素-抗毒素系统、kill开关、营养缺陷型、CRISPR靶向DNA降解和非标准氨基酸等，分析其协同作用及临床应用案例，指出标准化测试的必要性。

　　

Jay Fuerte-Stone|Mark Mimee

芝加哥大学微生物学委员会，美国伊利诺伊州芝加哥市60637

基因工程微生物已被设计用于医学的许多领域。合成生物学的进步使得这些微生物能够在各种环境中实现多种用途。然而，这些进步伴随着对强大生物遏制策略的需求，以防止工程微生物的不必要定植和传播。在这篇综述中，我们讨论了用于生物医学应用的生物遏制策略的现状。现有的生物遏制策略包括毒素-抗毒素系统、杀灭开关、营养缺陷性、基于CRISPR的靶向DNA降解、非标准氨基酸以及物理屏障。我们讨论了这些策略单独使用或组合使用的效果及注意事项。此外，我们还探讨了这些策略在临床试验中的使用和有效性。最后，我们强调了需要对遏制逃逸情况进行标准化测试。随着这些工程微生物应用的不断推进，确保遏制策略也随之发展至关重要，以保障安全、最小化环境影响，并维护公众对这项重要工作的积极看法。

引言

合成生物学的进步使得工程微生物在医学中的应用成为可能。基因工程微生物（GEMs），即经过外源基因改造以改变功能的微生物，已被设计用于多种医疗用途，包括疫苗1, 2•, 3、诊断[4]、癌症治疗5, 6, 7, 8、代谢性疾病8, 9, 10, 11••以及胃肠道疾病12, 13。在实际应用中，生物遏制一直是这些微生物的一个关键问题。在开发这些技术时，应优先考虑减少其在宿主体内的长期稳定性和不受控制的传播，以避免伦理问题及剂量失控。此外，意外释放到环境中可能对生态系统造成影响[14]，同时也会对这些工程微生物的知识产权构成威胁。美国国立卫生研究院的指南规定，GEMs在非允许环境中的存活率或工程遗传物质的转移率应低于10⁸个细胞中的1个[15]。虽然已经开发出许多生物遏制策略来降低逃逸的可能性，但彻底消除这些微生物仍然具有挑战性，因为这些策略会迫使微生物寻找绕过这些保护机制的方法[16]。这些策略包括毒素-抗毒素系统、可诱导的杀灭开关、营养缺陷性、基于CRISPR的靶向DNA降解、使用非标准氨基酸（NSAAs）以及物理屏障（图1）。这篇简要综述将讨论用于生物医学应用的生物遏制系统的现状，以及它们在临床研究中的应用实例。

部分内容

毒素-抗毒素系统

毒素-抗毒素系统通过配对机制实现控制：当抗毒素缺失时，细胞会死亡。例如，限制酶EcoRI和EcoRI甲基化酶17, 18，以及针对16S rRNA的RNA酶colicin E3及其相应的免疫蛋白immE3 2•, 19, 20。早期的毒素-抗毒素系统将抗毒素基因整合到细菌基因组中，并将毒素置于带有抗生素抗性标记的质粒上，以维持其活性。

杀灭开关

杀灭开关是另一种生物遏制方法。在这种系统中，可诱导的启动子控制关键基因或毒素的转录，在非适宜条件下导致细胞死亡。诱导因素可以是多种类型，如小分子（如脱水四环素（aTc）或异丙基-β-D-硫代半乳糖苷18, 21, 42, 43, 44）、环境信号（如温度21, 44, 45和氧气46, 47）或营养物质（如半乳糖、纤维二糖或卟啉）11••, 43。这些机制可以有效地控制微生物的活动。

多层策略

可以结合多种生物遏制策略来更有效地清除微生物2•, 18。Nagasawa等人将NSAAs与毒素-抗毒素系统结合使用，通过将N^ε-苯氧基羰基-L-赖氨酸（ZK）引入不同的抗毒素中，使其依赖于这种外部提供的NSAA而变得营养缺陷性[2]。将该质粒系统引入E. coli和Salmonella enterica临床分离株后，体外逃逸率分别为5–8 × 10^-8和0.2–1 × 10^-8。

空间隔离

空间隔离系统也可用于GEM的生物遏制。半透膜和水凝胶等物理屏障可以用来将微生物与其环境隔开4, 54。在这种系统中，细菌无法逃脱其封装环境，但仍能与外部环境进行互动。细菌密度也可以作为一种控制工程功能的方法。在Huang等人的研究中，产生β-内酰胺酶（BlaM）但缺乏周质层的E. coli被有效隔离。

生物遏制系统的临床试验

多项临床试验已经应用了GEMs的生物遏制策略8, 9, 10, 11••, 12。对于人类使用的GEMs，采用了两种不同的策略。第一种策略利用无法在人体微生物组中定植的GEMs，其治疗作用在肠道传输过程中发挥作用。在这些案例中，生物遏制策略作为额外的安全保障，确保用药后微生物被清除。在一项I期临床试验中，使用了thyA突变株。

结论

尽管存在多种生物遏制方法，但它们防止GEMs和转基因逃逸的能力差异很大。由于缺乏统一的测试标准，难以比较各种方法的效果。我们认为需要制定标准化基准，例如美国国立卫生研究院规定的10⁸个细胞中仅有1个GEMs存活的准则[15]，以及量化GEMs和通过水平基因转移（HGT）传播的转基因逃逸的方法。任何基准都需要标准化的方法才能具有实际意义。

利益冲突声明

作者声明以下可能构成潜在利益冲突的财务利益和个人关系：Mark Mimee表示得到了美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）和国家癌症研究所（National Cancer Institute）的财务支持；Mark Mimee还得到了美国国立普通医学科学研究所（National Institute of General Medical Sciences）的支持；Jay Fuerte-Stone得到了美国国立卫生研究院的支持。

致谢

作者得到了美国国立卫生研究院（IMSD项目5R25GM109439-07和分子与细胞生物学培训项目T32 GM007183对J.F.-S.的支持；美国国立卫生研究院的国家普通医学科学研究所（R35GM147478；M.M.）的支持；以及Arnold和Mabel Beckman基金会通过Beckman青年研究员计划（M.M.）的支持。