《Fish & Shellfish Immunology》：Rolling Circle Amplification-based Self-assembled CpG Nanoparticles: Immune Activation and Prevention of
Edwardsiella piscicida
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高效稳定的CpG DNA纳米颗粒制备及其水产疫苗佐剂应用研究。通过滚环扩增（RCA）技术将1826-F ssDNA环化扩增并自组装成纳米颗粒，显著提升核酸酶抗性（24h降解率较线性对照低4倍），在体外有效激活巨噬细胞炎症因子通路，体内实验显示其与灭活疫苗联用对爱德华氏菌感染的保护率达94.4%，较硫代修饰佐剂提高11.1%。该成果为水产疫苗开发提供了新型纳米佐剂体系。
李文梅|郭晨晨|吴凯新|谢群瑞|杨建业|沈爱文|刘琴|任玉红
中国华东科技大学上海光遗传细胞代谢技术前沿科学中心生物反应器工程国家重点实验室，上海200237
摘要
未甲基化的胞嘧啶-鸟嘌呤寡脱氧核苷酸（CpG ODNs）通过Toll样受体9（TLR9）的识别具有强烈的免疫刺激作用，但其应用受到核酸酶降解和高成本的限制。本文设计了一种ssDNA片段（1826-F），使用T4 DNA连接酶将其环化，并通过Phi29聚合酶进行滚环扩增（RCA），自组装成平均粒径为63.05 nm、ζ电位为-5.75 mV的RCA-1826纳米颗粒。通过核酸酶抗性实验评估其降解稳定性，结果显示RCA-1826在24小时内降解缓慢，而线性对照1826-R在6小时内完全降解。体外实验中，用RCA-1826处理小鼠巨噬细胞（RAW264.7）和斑马鱼肝细胞（ZFL），结果显示炎症因子表达显著上调，证实了其免疫刺激活性。体内实验中，给予1 μg RCA-1826可诱导斑马鱼产生强烈的先天免疫反应。与灭活疫苗联合使用时，RCA-1826作为有效的佐剂，对Edwardsiella piscicida的防护效果达到94.4%，这一保护率比硫修饰的ODN1826佐剂疫苗（83.3%）高11.1%。总体而言，基于RCA的合成方法能够制备出稳定的、具有免疫原性的CpG DNA纳米颗粒，表明RCA-1826是水产养殖中预防Edwardsiella piscicida的有希望的候选物质。
引言
源自细菌DNA的胞嘧啶-鸟嘌呤基序（CpG）的免疫佐剂特性最早于1995年报道[1]。合成的未甲基化CpG寡脱氧核苷酸（ODNs）通过模拟微生物核酸来激活先天免疫[2]。机制上，CpG ODNs作为病原体相关分子模式（PAMPs）与Toll样受体9（TLR9）结合，从而触发下游信号级联反应，诱导促炎细胞因子的分泌[3]。因此，CpG ODNs作为疫苗佐剂具有广泛的应用前景。
天然磷酸二酯骨架的CpG ODNs对核酸酶的抵抗力较差，而经过磷硫酸修饰的CpG ODNs则表现出更强的稳定性[4]。传统的化学修饰CpG ODNs生产依赖于固相合成，这一过程需要大量有机溶剂，成本高昂且耗时较长，同时对环境造成较大影响[4],[5],[6]。因此，CpG ODNs易受酶降解的影响，加上化学合成的经济和生态负担，限制了其广泛应用。
滚环扩增（RCA）是一种等温核酸扩增技术[7]。该方法使用环状单链DNA（cssDNA）作为模板，在聚合酶的作用下，通过链置换和持续催化作用生成含有重复序列的长链ssDNA分子[8],[9]。适用于滚环扩增的DNA聚合酶包括Phi29、Vent和Bst DNA聚合酶[10]。其中，Phi29 DNA聚合酶因其高效的过程性、强的链置换活性和高复制保真度而被广泛用于RCA[11],[12]。可以通过工程改造cssDNA模板，使其包含功能性元件——如DNA适配体[13],[14]、CpG基序[15],[16]和限制性酶切割位点[17]——从而将RCA产物自组装成纳米结构，提高其抗核酸酶能力[5],[18]。
在本研究中，我们尝试使用RCA技术合成含有ODN 1826的纳米颗粒，并评估其作为疫苗佐剂的效力。设计了一种含有HindIII限制性位点、多胞嘧啶序列（poly C）和ODN 1826的ssDNA片段（1826-F），并通过酶促连接形成cssDNA。随后以cssDNA为模板进行滚环扩增，生成含有重复ODN 1826序列的长链ssDNA。持续搅拌促使ssDNA自组装成RCA-1826纳米颗粒。对这些纳米颗粒进行了结构完整性、DNase抗性、RAW264.7巨噬细胞中的免疫刺激活性以及针对Edwardsiella piscicida的免疫增强效果的评估。
部分内容摘录
细胞系、细菌菌株和鱼类
小鼠巨噬细胞系RAW264.7（中国富恒）在含有10%胎牛血清（FBS，ExCell Bio，中国）和1%青霉素-链霉素（Yeasen，中国）的Dulbecco改良 eagle培养基（DMEM，Gibco，美国）中培养，培养条件为5% CO2、37°C。
斑马鱼肝细胞系（ZFL，中国CZRC）在含有10% FBS（ExCell Bio，中国）的DMEM/F12培养基中培养，培养温度为28°C。细胞每3-4天以1/3的比例传代。
RCA-1826的制备
T4 PNK和Phi29 DNA聚合酶在体外条件下表达（图1B-E）。分子量为35 kDa的T4 PNK主要存在于上清液和沉淀物中；分子量为37 kDa的Phi29 DNA聚合酶主要存在于上清液中。纯化后的这两种聚合酶用于RCA-1826的合成（详见图1A）。合成的cssDNA产物通过15%聚丙烯酰胺凝胶电泳（图1F）进行分析，结果显示有多条明显的条带。
讨论
为了开发高效且易于生产的基于CpG的疫苗佐剂，本研究设计了一种包含ODN 1826、poly G和Hind III限制性位点的结构化序列。利用RCA技术，我们合成了一种名为RCA-1826的单链DNA产物，该产物能够通过酶促反应生成CpG佐剂，并自发自组装成具有增强生物稳定性的抗核酸酶纳米结构。RCA-1826能够被巨噬细胞和ZFL细胞有效内化。
数据可用性
数据详见全文。本研究生成的质粒和菌株可根据合理请求向相应作者索取。
作者贡献声明
李文梅：数据整理、研究、可视化、撰写——初稿；郭晨晨：数据整理、研究、可视化、撰写——初稿；吴凯新：研究、撰写——初稿；谢群瑞：研究；杨建业：研究；沈爱文：研究；刘琴：概念构思、资金筹集、项目管理；任玉红：概念构思、资金筹集、项目管理、监督、撰写——审阅和编辑。
致谢
本工作得到了国家重点研发计划（2023YFD2400702）、青岛海洋科学技术中心（11–04）和上海农业科技创新计划（K2023014）的资助。
