《Food Bioscience》：Cryoprotective Effects and Mechanisms of Heterologously Expressed Wheat-Derived Antifreeze Peptide on Probiotics
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重组小麦抗冻肽（WAFP）对乳酸菌冻融损伤的防护机制及效能研究。WAFP通过抑制冰晶再结晶、维持膜完整性和调节脂质有序性等多层次机制保护益生菌，其保护效果与传统抗冻剂相当且更安全。摘要：
刘晓歌|王静静|曲英英|潘龙|王欣|张康毅|刘全平|刘娜|黄继红|廖爱梅
河南省粮食资源、保护与利用重点实验室，河南工业大学生物工程学院，郑州450000，中国
摘要
本研究全面探讨了由大肠杆菌表达的重组小麦来源的抗冻肽（WAFP）对益生菌菌株的冷冻保护效果及其潜在机制。同时进行了结构表征、理化性质分析、抗冻活性研究以及蛋白质组学分析。结果表明，WAFP的二级结构中包含41.2%的随机卷曲和11.4%的β-转角，这是功能性抗冻肽的典型特征。WAFP表现出0.09至0.22°C的热滞后现象，并能有效抑制冰晶重结晶，使形成的冰晶比对照组更小且更均匀。通过对表达宿主的蛋白质组学分析，发现了1138个差异表达的蛋白质，其中大部分与核糖体生物合成、代谢途径和应激响应过程相关，表明细胞适应了WAFP的产生。在快速冻融循环中，5 mg/mL的WAFP对植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）和嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）具有与传统冷冻保护剂（如脱脂牛奶和蔗糖）相当的保护效果，并具有其自身的优势。这通过处理后益生菌的细胞活力、代谢活性和膜完整性的保持得到了证实。进一步的保护机制研究表明，WAFP的作用涉及多个层面：保护关键糖酵解酶的活性、维持细胞膜完整性和潜在功能以及调节膜脂质有序性。总体而言，这些结果表明WAFP是一种有前景的天然冷冻保护剂，适用于益生菌在快速冻融条件下的保存，并可作为食品工业中的绿色替代品。
引言
抗冻蛋白（AFPs）是一类能够调节冰晶生长并保护各种生物免受冷冻温度有害影响的多肽（Bayer-Giraldi等人，2018年）。AFPs通过不可逆地结合在冰晶表面、抑制其生长、改变其形态和防止重结晶来增强冷冻食品的冷冻保护性能。杜H.和钱Q.（2011年）发现，用AFPs处理后，猪肉饼的冰晶尺寸和滴汁损失均有所减少。研究还表明，经过AFPs处理的肉饼比未经处理的对照组样品具有更高的硬度和弹性。类似地，杜X.等人（2021年）通过实验发现，在含有2.0 g/L AFP的环境中，镜鲤经历了五次冻融循环，期间鱼体内的水分迁移得到了有效抑制，从而导致羰基含量和TBARS值显著降低。
除了食品保存之外，冷冻保护剂在工业加工和储存过程中对维持益生菌的活力也起着关键作用（孙等人，2023年）。益生菌，特别是乳酸菌（LAB）如乳杆菌和双歧杆菌，因其健康益处而被广泛用于功能性食品和膳食补充剂中（陈H.等人，2019年）。然而，这些微生物对冷冻和冻干过程非常敏感，而这些过程对于长期保存和商业分销至关重要。在冻干过程中，细胞内和细胞外冰晶的形成、渗透脱水以及膜相变会导致细胞膜、蛋白质和核酸的不可逆损伤，从而导致活力和功能活性的大幅损失（陈X.等人，2019年）。在工业实践中，LAB通常被制成冻干粉末以确保储存稳定性和便于运输。然而，传统的冷冻保护剂如脱脂牛奶、蔗糖和甘油虽然常用，但在解冻过程中对冰晶重结晶的保护作用有限——这一过程可能造成的机械损伤甚至比初始冷冻更严重（陈等人，2023年）。此外，某些冷冻保护剂（例如DMSO）可能会引入细胞毒性或影响最终产品的感官特性。因此，迫切需要开发新型、高效且食品安全的冷冻保护剂，以有效减轻益生菌配方中的冻融损伤。
小麦来源的抗冻肽（WAFP）是一种有前景的替代品，因为它可以通过小麦蛋白的酶解获得——这是一种丰富且成本效益高的来源。在本研究中，使用了重组表达的WAFP版本，以确保结构均匀性并便于进行精确的机制研究，从而区别于直接通过酶解获得的肽。WAFP的特点是含有高比例的脯氨酸残基，这些残基有助于形成特定的二级结构，从而赋予其强烈的冰晶重结晶抑制（IRI）活性（袁等人，2025年）。这一结构特征，加上其食品级的安全性，使得WAFP特别适用于食品保存、农业抗寒性和生物样本储存（Ekpo等人，2022年）。此外，鉴于其已证明的冷冻保护性能，WAFP作为益生菌保存的新冷冻保护剂具有巨大潜力——这是功能性食品行业的一个关键需求（陈等人，2020年）。然而，尽管具有这些优点，但对WAFP在冻干过程中保护乳酸菌的效果以及其保护机制在分子水平上的全面阐明仍大多尚未探索。
为了解决这些问题，本研究采用大肠杆菌BL21(DE3)作为WAFP的生产表达宿主，克服了传统提取方法的局限性。我们使用多种分析技术系统地表征了WAFP：圆二色光谱（CD）用于二级结构分析，差示扫描量热法（DSC）用于理化性质评估，以及氨基酸组成分析以鉴定关键残基。此外，结合肽组学和生物信息学方法来研究WAFP的复杂成分并识别潜在的冰结合位点，从而对其抗冻活性提供机制见解。此外，为了填补益生菌冷冻保护研究的空白，我们评估了WAFP在两种代表性益生菌菌株——植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）和嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）在不同冷冻应力条件下的冷冻保护效果。从多个角度系统地研究了保护机制，包括细胞活力评估、膜完整性分析、关键酶活性分析以及超微结构表征。这种综合方法旨在阐明WAFP如何与LAB细胞和冰晶相互作用以减轻冻融损伤。这些发现不仅加深了我们对抗冻肽结构-功能关系的理解，还为优化WAFP和开发更有效的冷冻保护剂奠定了基础，特别是在益生菌保存和稳定口服疫苗配方方面。
材料
大肠杆菌BL21(DE3)细胞和大肠杆菌DH5α细胞购自北京Trans Gen Biotech有限公司。益生菌菌株（包括嗜酸乳杆菌和植物乳杆菌）由工业微生物菌株保存工程实验室提供。Luria-Bertani培养基（LB培养基）购自山西海博生物技术有限公司。异丙基β-D-1-硫代半乳吡喃糖苷（IPTG）购自北京Solarbio科技有限公司。
小麦来源抗冻肽的表达与纯化
重组质粒pET28a-WAFP（6135 bp）成功构建并转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中。通过菌落PCR筛选出阳性克隆，并通过BamHI和XhoI限制性酶切确认WAFP基因（816 bp）的正确插入（图1A）。DNA测序进一步验证了构建质粒的正确序列。在IPTG诱导后，重组WAFP以可溶形式表达，这一点通过SDS-PAGE分析得到证实。结论
本研究成功实现了WAFP在大肠杆菌BL21(DE3)中的异源表达，并系统评估了其对益生菌的冷冻保护效果。重组WAFP被纯化至高纯度，其二级结构以随机卷曲（41.2%）和β-转角（11.4%）为主，这是功能性抗冻蛋白的特征。该肽表现出0.09-0.22°C范围内的热滞后现象，并能有效抑制冰晶重结晶。
CRediT作者贡献声明
曲英英：方法学、验证。王静静：研究、正式分析、初稿撰写。刘晓歌：初稿撰写、正式分析、研究。刘全平：监督、审稿与编辑。张康毅：验证、方法学。王欣：可视化、软件处理。潘龙：数据管理、资源获取。廖爱梅：资金获取、概念构思、监督、初稿撰写。黄继红：资源获取、利益冲突声明
我们在此确认，本手稿中的研究内容是原创的，尚未在其他地方发表或考虑发表。此外，我们声明提交本手稿不存在任何利益冲突。所有作者均已审阅并同意提交和发表该手稿。致谢
本工作得到了河南省关键研发项目（231111310700和241111310500）以及河南省重点科技专项项目（231100110300）的财政支持。该研究还得到了河南省博士后研究项目（HN2025152）、河南工业大学青年骨干教师培养计划以及学校教育教学改革研究与实践项目的支持。
