《Food Bioscience》：Phenolic compounds from spontaneously fermented coffee beans alleviate cellular stress and modulate inflammatory signaling in lipopolysaccharide-treated RAW264.7 macrophages
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发酵与未发酵咖啡提取物的酚类成分差异及其抗炎活性研究显示，发酵咖啡通过释放更多酚酸和黄酮类化合物（如咖啡酸、木犀草素等）显著抑制LPS诱导的巨噬细胞炎症反应，降低NO产量并调节MAPK和JAK-STAT信号通路。
吴汉静|Marissa K. Caldow|Audrey S. Chan|刘子瑶|Gordon S. Lynch|Hafiz A.R. Suleria
澳大利亚维多利亚州帕克维尔3010，墨尔本大学科学学院农业、食品与生态系统科学系
摘要
咖啡豆收获后通常会进行自然发酵处理，这会改变咖啡豆的化学成分和生理特性。然而，自然发酵对咖啡提取物抗炎性能的影响尚未得到研究。本研究探讨了浅烘焙发酵（F）和未发酵（UF）Coffea arabica咖啡提取物的酚类成分、体外抗炎潜力以及潜在的信号通路。通过液相色谱-电喷雾离子化-四极杆飞行时间串联质谱（LC-ESI-QTOF-MS/MS）技术，初步鉴定了47种酚类化合物。其中，F提取物中的24种酚类化合物主要为酚酸和黄酮类化合物，而UF提取物中仅含有5种酚类化合物。抗炎潜力在脂多糖（LPS）刺激的RAW 264.7细胞中进行了评估。F提取物能更好地保护细胞免受LPS诱导的细胞死亡，并在48小时后减少一氧化氮（NO）的产生。在细胞形态方面，虽然F提取物缓解了巨噬细胞的树突分化，但在LPS+咖啡提取物处理后，参与这一过程的潜在转录因子（c-Fos和Socs1）的mRNA表达下调。经过4小时F提取物处理后，Shp2、Erk1/2、p38和Cox-2的mRNA表达下调，而Il-10、Sod2、Ccl2、Il-6和Il-1β的mRNA表达显著增强。自然发酵有助于酚类化合物的释放和微生物代谢。发酵咖啡提取物独特的酚类谱型可能使其具有更好的抗炎生物活性和对细胞应激的调节作用，这可能与MAPK和JAK-STAT信号通路有关，为其作为功能性咖啡产品的基础提供了支持。
引言
咖啡是全球最受欢迎的非酒精功能性饮料之一。人们对咖啡的需求不断增加，这归因于其独特的感官特性及其对人类健康的潜在保护作用（Daneschvar等，2021年）。咖啡豆富含生物活性化合物，尤其是酚类化合物，如咖啡酸、阿魏酸和绿原酸，这些化合物与咖啡消费与降低氧化应激和炎症相关慢性疾病风险之间的关联有关（Dludla等，2023年；吴等，2022a年）。
炎症是由免疫系统对外源性和内源性刺激引发的一系列保护性反应（Menzel等，2021年）。通常，单核细胞在组织中分化为巨噬细胞或未成熟的树突状细胞（DCs）。未成熟的DCs在暴露于促炎细胞因子（如脂多糖（LPS）和其他环境因素后发育为成熟的DCs，并在初级免疫反应中向幼稚T细胞呈递抗原（Rigamonti等，2023年；Trzebanski等，2024年；Villar等，2023年）。巨噬细胞是调节和维持体内平衡的最早参与的细胞类型之一，它们合成炎症细胞因子，如肿瘤坏死因子（TNF）和白细胞介素（IL）（Yunna等，2020年）。根据环境变化，巨噬细胞可以极化为M1和M2两种表型，分别发挥促炎和抗炎作用。在某些情况下，巨噬细胞和DCs之间可以相互转化，但其具体机制尚不清楚（Ma等，2015年；Saxena等，2003年）。
炎症、氧化应激和硝化应激之间存在密切的相互依赖关系（Castellani等，2014年；Khansari等，2009年）。氧化应激通常是由于活性物质（主要是活性氧（ROS）和活性氮物质（RNS）的生成与抗氧化防御之间的不平衡引起的（Biswas，2016年）。在炎症过程中，活化的巨噬细胞会产生大量ROS和RNS来对抗入侵物质（Fialkow等，2007年），但如果炎症部位的活性物质积累过多，可能会导致过度的氧化应激。相反，ROS和RNS引发的细胞内信号会增强促炎基因的表达（Biswas，2016年；Gu等，2023年）。不受控制和持续的炎症及氧化应激会导致组织和DNA损伤、某些慢性疾病以及与年龄相关的疾病（Jung等，2017年；Khansari等，2009年）。
不同的加工方法会导致咖啡豆发生不同的代谢反应，从而改变其化学成分，尤其是发酵和烘焙（Elhalis等，2020年；吴等，2022年）。利用本地微生物进行自然发酵是一种常见的方法，用于收获后从成熟的咖啡果粒中获取生咖啡豆（Haile & Kang，2019年）。微生物代谢涉及多种酵母和细菌，促进咖啡果粒的发酵，帮助释放和水解酚类化合物，从而改变其生物利用度和生物活性（Lee等，2017a年；吴等，2023年）。由于咖啡出色的抗氧化活性和抗炎特性，长期饮用咖啡与潜在的健康益处之间的关联一直备受关注（Rebollo-Hernanz等，2019年）。尽管许多体外和体内研究探讨了烘焙条件与咖啡生物活性之间的关系（Anese等，2023年；Choi等，2018年；Gamboa-Gómez等，2024年；Jung等，2017年；Paur等，2010年），但很少有研究关注自然发酵对其抗炎性能的影响。
在本研究中，我们使用脂多糖（LPS）刺激的RAW264.7巨噬细胞作为炎症模型，评估了自然发酵（F）和未发酵（UF）咖啡提取物的抗炎性能。我们利用这些细胞研究了咖啡提取物处理后的一氧化氮生成、细胞形态变化以及促炎和抗炎细胞因子的mRNA表达。通过LC-ESI-QTOF-MS/MS进行非靶向鉴定和表征，研究了两种类型咖啡提取物之间的酚类成分差异，以解释观察到的抗炎反应差异。
样本制备
三批商业化的自然发酵（F）和未发酵（UF）肯尼亚K7阿拉比卡（Coffea arabica）绿咖啡豆（每批500克）由澳大利亚当地咖啡农场Mountain Top Estate（新南威尔士州Nimbin）提供，作为三个生物学重复样本。绿咖啡豆使用中国广州的Cafemasy咖啡烘焙机（型号SCR-301）自烘焙至浅烘焙程度（200°C，15分钟）。咖啡烘焙机已预热至所需温度
检测到的酚类化合物分布
采用非靶向方法分析了发酵（F）和未发酵（UF）咖啡提取物中的酚类化合物，基于它们的m/z值和负离子及正离子模式下的质谱谱进行初步鉴定和表征。在F和UF咖啡提取物中鉴定了47种酚类化合物（图1a）。F咖啡提取物中含有24种独特的酚类化合物，这些化合物在UF提取物中不存在，其中包括10种酚酸（图1b）和9种黄酮类化合物结论
自然发酵和未发酵的咖啡提取物在LPS刺激的RAW264.7巨噬细胞中具有长期的抗炎性能和急性细胞应激缓解作用。这些效应在发酵咖啡提取物中更为显著，这可能归因于其中多种独特的酚类化合物，这些化合物通过Revident LC/Q-TOF技术得到了表征，如阿魏酸、阿魏酸酯、3-CQA、3-FQA和咖啡酸。这些化合物可能更容易被释放、异构化和转化
作者贡献声明
吴汉静：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、数据可视化、软件应用、方法论设计、研究实施、资金获取、数据分析、概念构建。Marissa K. Caldow：撰写——审阅与编辑、数据可视化、结果验证、研究监督、软件应用、方法论设计、研究实施、概念构建。刘子瑶：撰写——审阅与编辑、软件应用、方法论设计。Audrey S. Chan：撰写——审阅与编辑、数据可视化、结果验证、研究监督、方法论设计
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。
资助
本工作得到了澳大利亚政府的支持，Hafiz Suleria获得了澳大利亚研究委员会的资助（ARC-DECRA—DE220100055），墨尔本大学通过McKenzie奖学金计划（资助编号UoM-18/21）、未来食品Hallmark研究计划基金（资助编号UoM-21/23）以及合作项目的支持。吴汉静还获得了墨尔本大学提供的研究奖学金（资助参考编号：767803）。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。
