SPI-没食子酸-瓜尔胶三元复合物的制备与物理化学性质研究：对共价键合及结构可调性的探讨

《Food Chemistry》：Fabrication and physicochemical characterization of SPI-gallic acid-guar gum ternary complexes: Insights into covalent bonding and structural tunability

大豆分离蛋白与没食子酸、卡拉胶共价修饰后形成三元复合物，通过优化反应时间和浓度，验证了GA的接枝效率及GG对热稳定性的改善作用。光谱和显微分析显示SPI的二级结构向β-折叠转变，溶解度提升至43.56%，表面疏水性降低68.88%，证实三元系统协同增强稳定性和抗氧化能力。

　　

徐明泽|顾晨|阿里·库巴伊布|尹佩佩|刘昌|孙睿|刘睿|葛庆峰|于海|吴曼刚

中国江苏省扬州市扬州大学食品科学与工程学院，邮编225127

摘要

本研究旨在制备大豆蛋白分离物（SPI）-没食子酸（GA）-瓜尔胶（GG）三元共轭物，并探讨共价修饰与SPI构象、微观结构及理化性质变化之间的关系。在SPI-GA二元体系中，优化了反应时间和GA浓度；在5 mg/mL GA浓度下反应4小时可获得最高的接枝度和抗氧化能力，而在较高GA浓度下接枝效率部分下降，这可能是由于醌类物质自聚化降低了亲电性并增加了空间位阻。在SPI-GA-GG三元体系中，通过改变加热循环来优化糖基化和褐变指数。多尺度分析（SDS-PAGE、FTIR、CD、荧光光谱、SEM）显示共价网络未发生主链断裂，α-螺旋减少而β-折叠/无规卷曲增加，色氨酸微环境趋向亲水性。功能方面，溶解度提高到43.56%，而表面疏水性指数相对于天然SPI降低了68.88%；GG缓解了GA引起的热不稳定性，从而制备出一种可调且过程稳定的功能性食品成分。

引言

近年来，公众对高质量营养的兴趣显著增加（Salve, Pegu, & Arya, 2019; Wu et al., 2025）。植物蛋白因其高营养价值和可持续生产方式，已成为开发食品补充剂的重要目标（Fu et al., 2023; Ravindran, Singh, & Singha, 2024）。近年来，由于富含必需氨基酸和良好的技术功能特性，大豆蛋白分离物（SPI）在食品加工和功能性食品中得到广泛应用（Cheng, Ye, & Singh, 2024; Liu et al., 2025; Xu et al., 2024; Yeboah et al., 2025; You, Yang, Chen, Xiong, & Yang, 2021）。特别是作为油水（O/W）乳液中的乳化剂时，SPI可在油水界面形成粘弹性膜，提供静电排斥和空间位阻，有效抑制液滴聚集（da Silva et al., 2025）。然而，这些膜对热、离子强度和pH等环境因素非常敏感，导致稳定性降低（Wang et al., 2020）。

为了解决这些问题，人们采用共价修饰方法将蛋白质与多酚或多糖结合，以增强稳定性和功能性（Ali et al., 2026; Ali et al., 2026; Kim, Wang, & Selomulya, 2024; Xia, Xue, & Wei, 2021）。例如，通过将天然多酚或多糖共价接枝到蛋白质上，可以引入额外的疏水位点，增加分子柔韧性，并形成更厚、更粘弹性的界面层，从而提高界面活性和自由基清除能力（Wei & Huang, 2019; Zembyla, Lazidis, Murray, & Sarkar, 2020; Zhang et al., 2023）。然而，由蛋白质复合物稳定的乳液在恶劣条件下仍可能表现出有限的抗性（温度、离子强度和pH），且过量的多酚可能导致蛋白质聚集，进而影响乳液稳定性（Baba, Khan, Nazir, & Maqsood, 2025; Zhu, Zhu, Yang, Wang, & Tan, 2025）。因此，将多糖引入蛋白质-多酚体系（或将多酚引入蛋白质-多糖组装体）已成为构建蛋白质-多酚-多糖三元共轭物的常用方法，旨在形成更厚、更密的界面层，具有更强的静电排斥和空间位阻（Li et al., 2024; Luan et al., 2023）。这种协同作用与多种模式相互作用有关，包括蛋白质-多糖复合作用（静电相互作用、疏水相互作用和氢键作用），以及主要由疏水相互作用和氢键作用驱动的多酚-蛋白质结合，这些相互作用共同增强了界面组织并同时提供了抗氧化功能（Wang et al., 2023; Xue et al., 2024; Zhu, Zhu, et al., 2025）。例如，在乳清蛋白体系中，Gao和Qiu（2025）开发了一种由乳清蛋白分离物、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）和阿拉伯胶组成的共价连接复合物，显著提高了抗氧化活性和肉桂醛的包埋率。尽管对三元共轭物的兴趣日益增长，但相关研究仍少于二元复合物的研究。特别是基于SPI的三元共轭物虽然已有报道，但其研究数量仍相对较少。此外，关于多糖掺入基于SPI的二元复合物后如何调节蛋白质构象和理化性质的证据仍然有限。

总体而言，通过结合界面强化和抗氧化功能，构建蛋白质-多酚-多糖三元共轭物已成为提高乳液系统理化稳定性和整体性能的有前景策略。在各种功能性成分中，没食子酸（GA）作为一种天然存在的多酚，在水果和茶叶中含量丰富，因其强大的抗氧化特性而受到广泛关注。在氧化条件下，GA可氧化为活性醌中间体，与蛋白质中的氨基或巯基发生共价相互作用，导致构象重排，从而改善界面行为和抗氧化性能。此外，GA已被证明能有效减缓蛋白质-脂质体系的氧化降解（Wang et al., 2022; Xiang et al., 2024）。瓜尔胶（GG）是一种主要由半乳糖和甘露糖单元组成的非离子多糖，因其优异的水溶性、成膜能力和界面活性而广泛应用于食品乳液。作为共稳定剂，GG与蛋白质协同作用，提供空间位阻和粘度贡献，增强理化稳定性和储存稳定性（Amjed, Zeshan, Farooq, & Naz, 2024）。

在本研究中，我们专注于构建和表征基于SPI的复合物作为乳化剂候选物。后续工作将评估其在乳液和乳液-凝胶体系中的性能。具体而言，通过漆酶介导的GA接枝到SPI上，随后与GG进行热诱导缩合来改性SPI。系统评估了配方比例和反应条件对接枝效率（GE）、总酚含量（TPC）、抗氧化能力和褐变指数（BI）的影响。为了进一步了解结构-功能关系，使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、圆二色光谱（CD）、荧光光谱、扫描电子显微镜（SEM）和差示扫描量热法（DSC）表征了结构和理化性质。总体而言，本研究阐明了三元复合物策略调节SPI界面组装和稳定性的机制，推进了人们对多糖掺入基于SPI的二元复合物后构象和理化变化的了解，并为功能性乳化剂的合理功能优化和广泛应用提供了理论基础。

材料

SPI（≥90%蛋白质）、GA（≥98%纯度）、GG（≥99%纯度，220 kDa）、漆酶（120 U/g）、1,1-二苯基-2-吡啶肼（DPPH）和8-氨基-1-萘磺酸（ANS）购自上海源野生物科技有限公司（中国上海）。Folin-Ciocalteu试剂和2,2′-偶氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（ABTS）购自上海桑冈生物科技有限公司（中国上海）。β-巯基乙醇购自中国国家医药集团化学公司

总酚含量和接枝效率

为了评估SPI和GA之间的共价相互作用，使用TPC和GE作为指标。如图1A所示，TPC随GA浓度和反应时间的增加而显著增加（P < 0.05），在5 mg/mL GA浓度下反应4小时后达到最大值1.58 ± 0.01 mg/mL。结果表明，GA的可用性和酶催化时间的延长促进了酚类物质与蛋白质基质的共价结合。

值得注意的是，如图1B所示，尽管TPC增加

结论

本研究通过漆酶催化的多酚接枝和基于美拉德反应的糖基化成功制备了SPI-GA-GG三元共轭物。与SPI-GA二元体系相比，GG的加入促进了更强的共价结合和结构重塑。光谱和形态分析表明，三元共轭物导致SPI显著展开，表现为α-螺旋含量减少，β-折叠结构增加

CRediT作者贡献声明

徐明泽：撰写初稿、研究、数据分析、概念化。顾晨：验证、软件使用、资源提供、方法论设计、数据分析、概念化。阿里·库巴伊布：资源提供、数据分析、方法论设计、概念化。尹佩佩：资源提供、方法论设计、数据分析。刘昌：方法论设计、研究、数据分析。孙睿：方法论设计、研究、数据分析。刘睿：资源提供

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（项目编号：32272335）和江苏省研究生研究与实践创新计划（项目编号：SJCX24_2367、SJCX25_2426）的支持。