通过组合性PPT酶筛选和系统代谢工程优化，提高谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）中靛蓝素（indigoidine）的产量

《Food Bioscience》：Combinatorial PPTase screening and systematic metabolic engineering for high-level indigoidine production in Corynebacterium glutamicum

微生物来源的非天然蓝色素靛蓝素的异源生物合成系统构建及高效生产优化。通过筛选21种磷酸泛醌酰转移酶（PPTase），确定高效激活酶解基因的PPTase类型，结合宿主基因组敲除和代谢途径优化，显著提升工程菌株产量。摇瓶发酵达5.59 g/L，连续发酵突破34.45 g/L。

　　

Jiali Zhang | Zeyu Li | Rui Lu | Junsong Xiao | Yingying Zhu | Wei Xu | Wanmeng Mu

国家食品科学与资源重点实验室，江南大学食品科学与技术学院，中国江苏省无锡市，214122

摘要

靛蓝素是一种源自微生物的环保蓝色色素，作为合成染料的可持续替代品具有巨大潜力。在本研究中，我们在Corynebacterium glutamicum ATCC 13032中成功构建了一个高效的异源生物合成系统。首先引入了靛蓝素的异源合成途径，并通过筛选21种候选酶，鉴定出了最佳的磷泛硫醚转移酶（PPTase）来激活靛蓝素合成酶。随后，通过对底盘基因组中关键基因的组合敲除，缓解了前体供应的限制。在此基础上，对生物合成途径进行了系统优化，显著提高了产率。最后，针对工程菌株CG35优化了发酵参数和培养基组成。结果表明，在摇瓶培养中靛蓝素的最高产率达到5.59 g/L，在 fed-batch 发酵中达到34.45 g/L。

引言

公众对工业有毒化合物的生态和健康影响的担忧日益增加，推动了对天然、环境可持续替代品的需求（Wehrs等人，2019年）。纺织和染色行业广泛使用合成染料，因为它们具有丰富的颜色范围和成本效益（Heinz & Langhals，2003年）。然而，这些染料的制造过程经常使用有毒的化学前体，包括苯、喹啉、甲醛和二噁英（Ramesh等人，2019年）。一个典型的例子是靛蓝的工业规模化学合成，该过程仍然依赖于苯胺作为关键试剂（Cordin等人，2021年）。这凸显了开发能够在源头上防止污染物产生的环保染料替代品的重要性。作为响应，微生物生物合成作为一种可持续色素生产的变革性方法应运而生。在新兴解决方案中，靛蓝素作为一种非核糖体肽色素，由于其强烈的着色能力和多种功能特性（包括抗氧化和抗菌活性），显示出特别的前景（Ghiffary等人，2021年；Santos & Bicas，2021年）。

靛蓝素这种蓝色色素是由一个单模块非核糖体肽合成酶（NRPS）催化合成的，该酶促使两个L-谷氨酰胺分子发生缩合。这种酶通常包含四个核心结构域：腺苷化结构域（A结构域）、硫醇化结构域（T结构域）、氧化结构域（Ox结构域）和C端硫酯酶结构域（TE结构域）。A结构域特异性识别并激活两个L-谷氨酰胺分子，随后它们缩合并氧化形成最终的蓝色色素分子（Pang等人，2020年；Takahashi等人，2007年）。NRPS的催化活性依赖于其T结构域的翻译后磷泛硫醚化修饰。这一关键修饰由磷泛硫醚转移酶（PPTase）催化，它将辅酶A中的4′-磷泛硫醚基团共价连接到T结构域内的保守丝氨酸残基上（Beld等人，2013年）。参与靛蓝素生产的NRPS已在多种天然产生菌株中被鉴定出来，并在其生物合成中发挥关键作用。

PPTase在生物体中广泛存在。迄今为止，所有已鉴定的真菌和细菌NRPS以及I型和II型聚酮合成酶（PKS）都需要PPTase来催化辅酶A中的4′-磷泛硫醚基团（Ppant）到硫醇化结构域中保守丝氨酸残基的翻译后连接（Stack等人，2007年；Walsh等人，1997年）。PPTase主要分为三种类型：Sfp型、AcpS型和整合型PPTase（Mofid等人，2004年）。AcpS型特异性修饰脂肪酸合成酶（FASs）的载体蛋白（CPs）（Beld等人，2013年），而整合型PPTase是FASs的内在结构域，例如酵母中的I型FAS（Fichtlscherer等人，2010年），也存在于植物和细菌的几种PKS中（Copp & Neilan，2006年）。Sfp型PPTase以其广泛的底物选择性而著称，这使它们能够识别并修饰多种NRPS和PKS系统的载体蛋白结构域。因此，它们通常被认为与次级代谢相关（Schimming等人，2016年）。这一亚组以其原型Sfp（来自Bacillus subtilis）命名（Quadri，1998年）。研究表明，B. subtilis中的Sfp型PPTase与单模块NRPS BpsA的共表达能有效激活T结构域并显著提高靛蓝素的产率（Owen等人，2011年）。迄今为止，已有多个基因被用于靛蓝素的生物合成，包括Corynebacterium glutamicum ATCC 13032中的ppta（Ghiffary等人，2021年）、Bacillus subtilis中的sfp（Quadri，1998年）、Streptomyces verticillus ATCC 15003中的svp（Sánchez等人，2001年）、Streptomyces chromofuscus ATCC 49982中的Sc-indB（Yu等人，2012年）以及Erwinia chrysanthemi中的Ec-indB（Reverchon等人，2002年）。

目前，包括Escherichia coli（Xu等人，2015年）、C. glutamicum（Ghiffary等人，2021年）、Saccharomyces cerevisiae（Wehrs等人，2018年）、Rhodosporidium toruloides（Wehrs等人，2019年）、Aspergillus oryzae（Cullen等人，2022年）、Pseudomonas putida（Banerjee等人，2020年）和Vibrio natriegens（Tian等人，2023年）在内的多种微生物已被用于生产靛蓝素。C. glutamicum通常被认为是一种安全的（GRAS）微生物，并具有显著的L-谷氨酸生物合成能力，而L-谷氨酸是L-谷氨酰胺的直接前体。鉴于L-谷氨酰胺是靛蓝素生物合成的前体，C. glutamicum是生产靛蓝素的理想微生物底盘（Duperray等人，1992年；Schneider等人，2011年）。目前关于C. glutamicum中靛蓝素生物合成的研究已取得进展。Ghiffary等人异源表达了Streptomyces中的bpsA基因，并通过系统代谢工程策略，在摇瓶发酵中实现了21.2 g/L的靛蓝素产率（Ghiffary等人，2021年）。Cho等人利用一个广宿主范围的合成sRNA平台构建了一个基因组规模的敲除文库，通过高通量比色筛选找到了潜在的有益靶标。通过组合敲除，他们进一步将最终产率提高到54.9 g/L（Cho等人，2023年）。尽管之前在C. glutamicum中进行了高产靛蓝素的生产尝试，但对关键激活酶PPTase的系统筛选和优化仍然有限。因此，鉴定合适的PPTase以及底盘细胞的优化和途径调控对于实现高效靛蓝素生产至关重要。

在本研究中，通过异源表达靛蓝素合成酶基因bpsA和PPTase，在C. glutamicum ATCC 13032中成功建立了靛蓝素的生物合成途径。从21种潜在的PPTase中筛选出能够显著提高靛蓝素产率的变体。为了解决潜在的瓶颈，我们进一步通过组合基因组删除涉及靛蓝素生物合成的关键基因，构建了一个高性能的底盘。此外，我们还优化了参与三羧酸（TCA）循环的代谢途径基因的表达。最终，通过系统优化发酵参数和培养基组成，靛蓝素的产率显著提高。工程化的C. glutamicum菌株在摇瓶培养中的产率达到5.59 g/L，在5-L生物反应器中的fed-batch 发酵条件下达到34.45 g/L。

菌株和质粒构建

所有构建的菌株和质粒均列在补充材料中。使用C. glutamicum ATCC 13032作为靛蓝素生产的起始宿主。E. coli JM109菌株用于质粒构建和基因克隆。编码靛蓝素合成酶的优化密码子bpsA由Azenta GENEWIZ有限公司（中国苏州）合成，磷泛硫醚转移酶（PPTase）基因由南京GenScript Biotech有限公司合成。这些基因被组装在一起

筛选高效生产靛蓝素的微生物PPTase

为了通过完整的生物合成途径实现高效生产蓝色色素靛蓝素，我们在C. glutamicum ATCC 13032中建立了一个异源表达系统，用于共表达靛蓝素合成酶和PPTase。C. glutamicum具有完整的三羧酸（TCA）循环，能够内源性合成α-酮戊二酸，后者进一步转化为L-谷氨酸和L-谷氨酰胺——这两种物质是靛蓝素的直接前体（Sun等人，2025年）。

结论

在本研究中，我们通过系统代谢工程成功构建了一种高产靛蓝素的C. glutamicum ATCC 13032工程菌株。关键策略包括筛选高效的PPTase、重新编程底盘代谢网络、优化关键途径基因的表达以及系统改进发酵参数。最终工程菌株CG35在500 mL摇瓶培养中的靛蓝素产率达到5.59 g/L。

CRediT作者贡献声明

Jiali Zhang：撰写——原始草稿、可视化、实验研究。Zeyu Li：撰写——审阅与编辑、实验研究。Rui Lu：方法学、实验研究。Junsong Xiao：资源获取、实验研究。Yingying Zhu：方法学、实验研究。Wei Xu：监督、资金获取、概念设计。Wanmeng Mu：项目管理。

利益冲突声明

作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：我，Wei Xu，来自江南大学，是《Journal of Food Bioscience》的接收编辑。但我保证在提交过程中将严格遵守该杂志的所有规定。如果还有其他作者，他们声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响公正性

致谢

本工作得到了中央高校的基础研究基金（编号：JUSRP622008）的财政支持。