《Food Chemistry: X》：Effects of an enterocin-containing postbiotic on
Listeria monocytogenes: phenotypic and transcriptional insights in a cheese-mimicking matrix
编辑推荐：
该研究评估了肠球菌RM12产生的含肠毒素后生物Ef-ECP对单核细胞增生李斯特菌表型及基因表达的影响，发现Ef-ECP在抑制浓度和亚抑制浓度下均显著降低运动性、生物膜形成及细胞表面疏水性，并在奶酪模拟基质中呈现温度依赖性基因抑制效应，37℃效果优于7℃。研究指出冷藏条件下仍存李斯特菌活性风险，需多 hurdle 保存策略，为食品工业提供天然防腐方案。
莱昂纳多·曼奇尼（Leonardo Mancini）|弗朗切斯科·玛丽亚·卡拉布雷塞（Francesco Maria Calabrese）|西蒙娜·卡博内（Simona Carbone）|朱塞佩·切拉诺（Giuseppe Celano）|玛丽亚·德安杰利斯（Maria De Angelis）
意大利巴里阿尔多·莫罗大学（University of Bari Aldo Moro）土壤、植物与食品科学系，7012巴里
摘要
从肠球菌 RM12中提取的一种含有肠球菌素的益生元（Ef–ECP）被用于评估其对单核细胞增生李斯特菌 ATCC 19115的功能反应和基因表达的影响。测试了Ef-ECP在抑制浓度（1 × MIC）和亚抑制浓度（? × 和 ? × MIC）下的最小抑菌浓度（MIC）。在最佳实验室条件下（37°C的BHI肉汤中），Ef–ECP显著削弱了单核细胞增生李斯特菌的关键表型特征。在1× MIC浓度下，Ef–ECP显著抑制了其运动能力（游泳和群集能力降低了57%以上），将生物膜形成减少到对照水平的25%以下，并且即使在亚抑制浓度下也显著降低了细胞表面的疏水性和自聚集性。
为了评估Ef-ECP在食品环境中的行为，使用了一种由冻干布里奶酪（Brie cheese）制成的模拟奶酪的肉汤。通过对一组选定基因进行RT-qPCR分析，发现其效应具有温度依赖性。在类似奶酪的基质中暴露于Ef–ECP会显著下调关键的侵袭（inlA、inlB、inlC）、毒力（plcA、plcB、iap、prfA、sigB）、群体感应（agrA、agrD）、运动（flaA、actA）和耐酸（gadD）基因的表达，且在37°C时的抑制作用比7°C时更强。尽管Ef–ECP以温度依赖的方式降低了单核细胞增生李斯特菌的致病潜力，但在7°C时基因活性的持续存在突显了冷藏即食乳制品中的残留风险，因此需要采取多重防护措施。总体而言，Ef–ECP通过抗菌、抗生物膜和转录抑制等多种机制显著干扰了单核细胞增生李斯特菌的生理活动。我们基于益生元的方法为食品系统的应用提供了实际优势，有可能提升其工业适用性。
引言
单核细胞增生李斯特菌是一种普遍存在的致病微生物，在食品安全方面备受关注，能够在多种食品基质中存活和繁殖，包括肉类及其制品、乳制品、生食和加工海鲜以及生食或加工水果和蔬菜。其致病性依赖于参与粘附、侵袭、免疫逃逸、细胞内增殖和细胞间传播的基因的协同表达（Hadjilouka等人，2016年）。这种菌株的嗜冷生长特性进一步增加了即食食品的风险，成为一个重要的公共卫生问题（Park等人，2023a）。在即食产品中，如布里奶酪（Brie）和卡门贝尔奶酪（Camembert）等表面成熟的软质奶酪经常与李斯特菌病暴发有关，因为它们的营养成分丰富、水分活度高、pH值中性至微酸性以及脂肪含量高，这些条件有利于单核细胞增生李斯特菌在储存和运输过程中的存活和代谢（Buchanan等人，2017年）。单核细胞增生李斯特菌的固有耐受性，包括对广泛pH范围、高盐浓度和低温的耐受性，使其控制变得困难。此外，该菌株在食品接触面上形成生物膜的能力进一步导致加工设施中的持续污染，并形成可能交叉污染最终产品的菌库。这种持续性已与严重的疫情和巨大的经济损失相关联（Qiao等人，2020年）。
开发符合消费者需求的有效预防策略仍然是当务之急，人们对天然和安全防腐剂的需求日益增加，作为合成添加剂的替代品（Pingitore等人，2012年）。在天然防腐方法中，基于乳酸菌（LAB）及其代谢产物的生物防腐方法受到了越来越多的关注。从牛奶、植物和发酵食品中分离出的特定产菌素乳酸菌株显示出对单核细胞增生李斯特菌的强效抑制作用（Goyal等人，2018年）。在乳酸菌中，特别是肠球菌（Enterococcus faecium）和E. faecalis因其产生肠球菌素的能力而受到关注。肠球菌素被分为不同的类别（I、IIa、IIb、IIc、III、IV），其中大多数已鉴定的肠球菌素属于第二类（非兰蒂肽），如肠球菌素A、肠球菌素B和肠球菌素P，分子量通常为4–6 kDa（Franz等人，2007年；Kasimin等人，2022年）。肠球菌素在低浓度下对单核细胞增生李斯特菌特别有效，但由于天然菌株的产量有限，工业规模化应用通常需要进一步优化（Schittler等人，2019年）。
由于肠球菌素对致病性和腐败微生物具有特异性作用，它们被视为关键的功能成分；然而，由于生产成本高、稳定性问题、监管障碍、技术复杂性和消费者接受度等因素，其在食品系统中的实际应用仍然有限。为解决这些挑战，正在进行的研究和工业努力集中在开发更高效、可扩展且成本效益更高的生产和应用策略上（Singh等人，2025年）。因此，提出了一种使用益生元的策略，即“含有微生物生长过程中产生的生物活性化合物的无细胞制剂，如有机酸、肽和抗菌肽”，这被认为是一个有前景的方法（Moradi等人，2020年；Ashrafudoulla等人，2024年）。
与活菌培养物不同，含有菌素的益生元避免了与起始菌和辅助菌株的生存、生长兼容性或相互作用相关的问题，同时保留了抗菌、抗氧化和免疫调节作用。它们在不同pH值、温度和食品基质条件下的稳定性进一步增强了其在食品中的直接应用性（Barros等人，2020年）。此外，它们对胃肠道蛋白酶的敏感性增强了安全性，这些蛋白酶可以在体内无害地降解活性肽（Wang等人，2019年）。
很少有研究探讨肠球菌素对单核细胞增生李斯特菌生理特征的影响，而这些特征对其在食品加工环境中的持续存在至关重要。此外，关于在模拟食品基质的实际条件下（如乳制品）的分子反应（即转录变化）的知识仍然有限，尤其是考虑到单核细胞增生李斯特菌能够在复杂基质中调节其行为（Montiel等人，2019年；Pérez-Baltar等人，2022年）。该菌株的粘附能力、生物膜形成能力和毒力因子的表达对其在食品环境中的生存至关重要，其中生物膜赋予其对抗菌剂的抗性，而运动/毒力基因则使其能够侵入细胞并在细胞内存活（Park等人，2023a）。基因表达分析补充了表型测定和活菌计数，揭示了即使在无明显生长变化的情况下也可能发生的分子适应性反应。监测关键毒力相关基因的转录变化，有助于准确评估病原体的适应策略，并提供关于其致病潜力的见解（Montiel等人，2019年）。
了解生物防腐剂对单核细胞增生李斯特菌生理的影响对于揭示其应激反应机制和优化天然防腐剂的规模化应用方案至关重要。为此，我们评估了单核细胞增生李斯特菌对由E. faecium RM12产生的含有肠球菌素的益生元（Ef–ECP）的反应，包括其表型特征和基因表达。在我们之前对Ef–ECP的研究中，已经证明其在不同pH值、温度和化学条件下的抗李斯特菌活性（Mancini等人，2025年）。在本研究中，我们在最佳生长条件（37°C的BHI肉汤中）下，使用抑制性和亚抑制浓度的益生元评估了单核细胞增生李斯特菌的一些关键表型特征，包括生物膜形成、运动能力和与表面相关的毒力特征。为了研究单核细胞增生李斯特菌在含有Ef–ECP的食品模型（基于布里奶酪的肉汤）中的适应性基因表达，我们测试了两个生物学相关的温度：7°C和37°C。评估了选定毒力和应激相关基因的生长和转录调控情况。这种综合方法揭示了单核细胞增生李斯特菌如何在受控实验室培养基和真实食品环境中适应菌素诱导的应激，进一步深入了解了其在即食乳制品中的潜在行为和毒力。
章节片段
细菌菌株和生长条件
在我们之前的研究（Mancini等人，2025年）中，从生牛奶中分离出了E. faecium菌株RM12，并基于其无细胞上清液抑制单核细胞增生李斯特菌 ATCC 19115生长的能力进行了选择。经过蛋白酶处理后，其抗菌活性丧失，表明其具有蛋白质性质，但在广泛的pH值、温度和化学条件下保持稳定，适合用于食品防腐。'
最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）
通过肉汤稀释法测定Ef–ECP对单核细胞增生李斯特菌 ATCC 19115的抗菌活性，得到其MIC为47.31 mg/mL，而MBC（定义为防止BHI琼脂平板上可见生长的最低浓度）为94.62 mg/mL。为了定量测量抗菌活性，MIC和MBC值以每毫升生物单位（BU/mL）表示，基于琼脂孔扩散试验。
讨论
基于从E. faecium RM12（从生牛奶中分离）的无细胞上清液的抗李斯特菌活性，我们评估了其含有肠球菌素的益生元对单核细胞增生李斯特菌关键致病特征的影响。测试了Ef–ECP的抑制浓度（1 × MIC）和亚抑制浓度（? × MIC和? × MIC），以评估其对病原体运动能力（游泳和群集）、生物膜形成和消除以及细胞表面相关特征的影响。
结论
本研究的结果表明，含有肠球菌素的益生元是一种有前景的策略，可以限制单核细胞增生李斯特菌在食品基质中的持续存在和致病性。在我们的研究中，在最佳生长条件下，Ef–ECP处理损害了一些单核细胞增生李斯特菌的关键表型特征，尤其是在亚抑制浓度下也能观察到抑制效果。
CRediT作者贡献声明
莱昂纳多·曼奇尼（Leonardo Mancini）：撰写 – 原始草稿、可视化、方法学、数据管理、概念化。弗朗切斯科·玛丽亚·卡拉布雷塞（Francesco Maria Calabrese）：撰写 – 审稿与编辑、方法学、数据管理、概念化。西蒙娜·卡博内（Simona Carbone）：方法学、形式分析、数据管理。朱塞佩·切拉诺（Giuseppe Celano）：撰写 – 审稿与编辑、监督、方法学。玛丽亚·德安杰利斯（Maria De Angelis）：监督、项目管理、概念化
未引用参考文献
Cordero等人，2016年；Moradi等人，2023年；Peng等人，2023年；Zapa?nik等人，2022年。
伦理声明 - 人类和动物研究
作者声明本研究未涉及人类受试者或动物。
资助
该项目由意大利大学和研究部的国家恢复与韧性计划（NRRP）资助，属于任务4组件2投资1.3的一部分，招标编号341，发布于2022年3月15日，由欧盟 – NextGenerationEU资助；项目代码PE00000003，许可法令编号1550，发布于2022年10月11日，由意大利大学和研究部CUP D93C22000890001批准，项目名称为“ON Foods - 食品和营养可持续性研究与创新网络”，
利益冲突声明
? 作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。
