MT2A缓冲系统耗竭是重症COVID-19患者细胞凋亡（铜死亡）的标志：多组学整合、计算建模与实验验证

《Free Radical Biology and Medicine》：MT2A buffering exhaustion marks cuproptosis in severe COVID-19: Multi-omics integration, computational modeling, and experimental validation

铜依赖性细胞死亡与MT2A调控机制研究。本研究提出铜稳态失衡假说，揭示MT2A双相动态（急性上调→耗竭）与FDX1-PDH轴激活的关联，证实铜缓冲-执行失衡理论，并通过单细胞转录组、蛋白组及超声组学验证了其与重症COVID-19的病理关联及宏观影像标志物。

刘远水|韩峰|潘品华|李华梅

海南省人民医院急诊医学科（海南医学院附属海南医院），中国海南省海口市570311

摘要

背景

铜死亡（Cuproptosis）是一种新型的铜依赖性细胞死亡形式，与线粒体代谢和蛋白质脂质化密切相关。我们提出了“铜缓冲-执行失衡”（Copper Buffering-Execution Imbalance）假说，认为金属硫蛋白2A（MT2A）的耗竭会导致游离铜的积累，激活FDX1-PDH轴并触发线粒体铜死亡。金属硫蛋白（MTs）是铜稳态的关键调节因子，但它们在严重感染中的具体机制作用尚不清楚。

方法

我们采用了系统生物学方法，结合了计算机模拟和实验验证。我们分析了三个独立数据集的多组学数据：（1）GSE158055外周血单核细胞（PBMC）单细胞转录组学（24个与铜死亡相关的基因），（2）GSE145926支气管肺泡灌洗液（BALF）单细胞转录组学（31个基因），以及（3）Nie2021肺组织蛋白质组学（26个蛋白质）。我们进行了虚拟敲除模拟（scTenifoldKnk），包括阳性（MTF1）和阴性（B2M）对照组，并进行了种子敏感性分析以预测基因调控网络的扰动。研究结果通过LPS诱导的小鼠模型和床边肺超声（LUS）放射组学得到了验证。

结果

在分析的35个与铜死亡相关的基因中，我们发现：（1）MT2A在PBMC和BALF中的表达方向不一致（Wilcoxon检验，P < 0.05），表明其具有组织特异性调节作用；（2）单细胞伪时间分析重建了“氧化还原稳态崩溃的时空轨迹”，揭示了MT2A的“双相动态”（急性上调→耗竭）；（3）计算机模拟扰动分析证实MT2A的耗竭会触发FDX1-PDH执行轴的激活，这一点在小鼠模型中也得到了实验验证；（4）LUS放射组学熵值可以作为这种微观氧化损伤的宏观指标。

结论

本研究结合计算建模和实验证据，阐明了MT2A介导的“铜缓冲-执行失衡”网络，识别出针对严重COVID-19治疗的新氧化还原检查点。

引言

铜是一种对细胞代谢至关重要的过渡金属，作为线粒体电子传递链酶（如细胞色素c氧化酶）和抗氧化酶（如超氧化物歧化酶SOD1/3）的辅因子，在维持线粒体功能和清除活性氧（ROS）方面起着核心作用^[1]。然而，在威胁生命的状况（如败血症和严重冠状病毒病2019（COVID-19）[2], [3]）中，铜稳态的失调引起了越来越多的关注。这些疾病的共同病理特征——宿主免疫反应失调和“氧化风暴”——与细胞内铜分布的紊乱密切相关，但铜代谢失衡与免疫代谢崩溃之间的分子机制仍不清楚[1], [4]。

当细胞内游离铜浓度超过生理限度时，其氧化还原活性（Cu⁺/Cu²⁺循环）可以通过类似芬顿反应（Fenton-like reactions）催化羟基自由基（•OH）的生成，引发脂质过氧化、蛋白质羰基化以及DNA氧化损伤[5], [6]。2022年，Tsvetkov等人揭示了一种新型的铜依赖性细胞死亡形式，称为“铜死亡”^[7]。与经典的氧化应激诱导的细胞死亡途径不同，铜死亡主要通过铜离子与三羧酸循环中的脂质化蛋白质（如DLAT、DLD）直接结合而发生，导致脂质化蛋白质异常聚集和线粒体铁硫簇蛋白的丢失，最终引发线粒体代谢崩溃和蛋白质毒性应激[7], [8]。

金属硫蛋白（MTs）是一类富含半胱氨酸的低分子量蛋白质，具有强大的金属螯合和自由基清除能力^[9]。MT2A是人类体内表达最丰富的异构体，其20个半胱氨酸残基能够有效结合7个二价金属离子（如Cu²⁺、Zn²⁺），是维持细胞内铜稳态和抵御氧化损伤的主要“缓冲剂”。在生理条件下，MT2A不仅通过螯合作用防止铜参与氧化还原循环，还能直接清除•OH和过氧亚硝酸盐阴离子（ONOO^-），提供双重抗氧化保护^[10]。然而，在败血症和严重COVID-19的强烈炎症和氧化应激微环境中，MT2A的保护能力是否会被“耗竭”，以及这种耗竭是否会导致铜毒性从而引发铜死亡，目前尚不清楚。尽管最近的综述已经全面阐明了铜死亡的分子机制，但抗氧化“缓冲系统”（MTs）与促死亡“执行系统”（FDX1-PDH轴）之间的动态平衡仍需进一步探索^[11]。

在这里，我们提出了“铜缓冲-执行失衡”假说：在严重感染的情况下，免疫细胞会从“MT2A缓冲补偿阶段”病理进展到“缓冲耗竭阶段”。MT2A的上调是对氧化应激和铜过载的一种反应性保护机制。当MT2A的金属螯合和自由基清除能力因持续氧化应激而耗竭时，积累的游离铜离子会激活FDX1介导的脂质化蛋白质损伤途径，最终导致线粒体功能障碍和免疫细胞死亡。为了验证这一假说，我们整合了单细胞转录组学（scRNA-seq）、蛋白质组学和大规模临床队列转录组数据，以绘制COVID-19和败血症中与铜死亡相关基因的多维图谱。我们还结合了床边肺超声（LUS）放射组学，探索微观分子氧化还原失衡的宏观成像表现，旨在为重症患者的氧化应激监测和精准干预提供新的理论基础。

数据来源和预处理

本研究整合了三个独立数据集的多组学数据，系统地描述了严重COVID-19中的铜死亡现象。对于外周血分析，我们使用了包含COVID-19全临床谱系（对照组、轻度、中度、重度和危重病例）外周血单核细胞（PBMCs）单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据的GSE158055数据集。数据处理遵循了标准的Seurat流程，重点关注单核细胞

多组学鉴定MT2A为核心铜缓冲基因

我们对35个与铜死亡相关的基因进行了系统的多组学分析（表1）。

讨论

通过整合多组学数据、单细胞伪时间分析和独立的临床队列验证，本研究系统地阐明了MT2A介导的铜稳态-氧化还原调控网络及其在严重感染中的免疫调节功能。我们提出了并验证了“铜缓冲-执行失衡”假说：在持续氧化应激和铜应激的双重压力下，MT2A作为反应性保护机制发挥作用

结论

通过多组学整合策略，本研究系统地阐明了严重COVID-19中MT2A介导的铜死亡的氧化还原调控网络。主要发现包括：（1）MT2A的“双相动态”（急性上调→耗竭）解释了疾病进展过程中氧化还原稳态的崩溃；（2）铜缓冲系统（MT模块）与执行系统（FDX1-PDH轴）之间的失衡与疾病严重程度相关；（3）组织特异性调节（PBMC vs. BALF）

CRediT作者贡献声明

刘远水：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，方法学，研究，数据管理，概念化。李华梅：撰写 – 审稿与编辑，监督，项目管理，资金获取。韩峰：撰写 – 审稿与编辑，可视化，研究。潘品华：撰写 – 审稿与编辑，监督，资源提供

数据可用性

原始数据可从GEO数据库（GSE158055、GSE145926、GSE65682、GSE212865）和文献补充材料中获取。带有详细图例的补充表格以单独的Excel文件形式提供。

伦理声明

动物实验获得了机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准，并按照美国国立卫生研究院的实验室动物护理和使用指南进行。所有涉及动物的程序均符合ARRIVE指南。

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

资助

本工作得到了中国海南省自然科学基金（825RC864、825RC856、825QN539）；海南医学院的学术提升支持计划（XSTS2025168）；国家自然科学基金（8247012432）；国家重点研发计划（2022YFC2405204、2022YFC2504401）；富荣实验室的科学研究计划（编号2023SK2101）；以及中国国家重点临床专科建设项目的支持

利益冲突声明

作者声明没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

我们衷心感谢陈峰教授的慷慨、专业和细致的指导。同时，我们也感谢原始数据集的作者们公开分享数据。