《Journal of Advanced Research》：OTUD7B attenuates renal fibrosis by regulating PRDX1 protein stability
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本文聚焦慢性肾脏病(CKD)终末期的核心病理特征——肾纤维化的治疗难题。研究者通过系统研究，揭示了去泛素化酶OTUD7B通过拮抗E3泛素连接酶SMURF1，保护抗氧化酶PRDX1免受K63泛素化-溶酶体途径降解，从而缓解肾纤维化的新机制。该研究不仅阐明了“OTUD7B-SMURF1-PRDX1”轴的关键作用，也为开发靶向泛素化调控的新型抗纤维化疗法提供了潜在靶点。
慢性肾脏病（CKD）和终末期肾脏病（ESRD）严重威胁人类健康，而其进展的最终共同通路是肾纤维化。在这个过程中，肾脏的正常组织被过量的细胞外基质（如胶原蛋白）形成的疤痕组织所替代，导致肾功能逐渐丧失，患者最终可能不得不依赖透析或肾移植。尽管科学家们已知道转化生长因子-β（TGF-β）等信号通路在其中扮演关键角色，但对于驱动纤维化进程的更精细的分子“开关”，尤其是蛋白质的翻译后修饰如何调控这一过程，仍有很多谜团待解。其中，泛素化修饰——一种像“分子标签”一样调控蛋白质稳定性与命运的关键机制——在器官纤维化中的作用日益受到关注。那么，肾脏中是否存在关键的泛素化调控因子，能够成为遏制纤维化进程的“刹车”呢？
为了回答这一问题，来自武汉大学人民医院泌尿外科的研究团队熊玉峰等人，在《Journal of Advanced Research》上发表了一项研究。他们发现了一种名为OTUD7B的去泛素化酶（DUB），它就像一把“分子剪刀”，能够剪去特定蛋白质上的泛素链，从而阻止其被降解。他们的研究表明，在肾脏发生纤维化时，OTUD7B的表达会显著降低。更为重要的是，他们完整地揭示了一条全新的信号轴：OTUD7B通过拮抗E3泛素连接酶SMURF1，保护一种重要的抗氧化酶PRDX1，使其免于通过K63泛素化-溶酶体途径被降解，从而发挥缓解肾纤维化的作用。这项研究不仅为理解肾纤维化的分子机制提供了新视角，也提示靶向“OTUD7B-SMURF1-PRDX1”轴可能成为治疗肾纤维化的新策略。
研究人员综合运用了多种关键技术方法来验证他们的假设。在细胞层面，他们使用人肾近端小管上皮细胞（HK-2）并利用TGF-β等刺激建立纤维化模型。在动物层面，他们构建了单侧输尿管梗阻（UUO）和肾脏缺血再灌注（I/R）损伤两种经典的小鼠肾纤维化模型。此外，研究还纳入了临床样本进行分析，包括因严重梗阻导致功能丧失的肾切除标本和肾癌患者部分肾切除手术中的癌旁正常组织。关键实验技术包括：RNA测序（RNA-seq）与生物信息学分析以筛选差异表达基因；免疫沉淀结合质谱分析（IP-MS）以寻找OTUD7B的互作蛋白；免疫共沉淀（Co-IP）、GST pull-down实验以验证蛋白质相互作用；泛素化实验以检测蛋白质的泛素化修饰类型（如K63连接）和位点；以及使用蛋白质合成抑制剂（CHX）追踪、蛋白酶体抑制剂（MG132）和溶酶体抑制剂（氯喹CQ或巴弗洛霉素A1）处理，以确定蛋白质的降解途径。体内功能研究则通过尾静脉注射携带OTUD7B基因或短发夹RNA（shRNA）的腺相关病毒9（AAV9）以及使用肾小管特异性OTUD7B敲除小鼠来实现。
OTUD7B表达在肾纤维化模型中降低
研究人员首先对TGF-β处理的HK-2细胞进行RNA测序，在众多差异表达基因中筛选出泛素化相关基因，其中去泛素化酶OTUD7B的表达在纤维化细胞中显著下调。这一现象在TGF-β、血管紧张素II和H2O2诱导的细胞模型、UUO和I/R小鼠模型以及临床人肾组织样本中均得到一致验证，且OTUD7B的表达与纤维化标志物α-SMA呈负相关。单细胞RNA测序和免疫荧光定位显示OTUD7B主要在肾小管上皮细胞中表达。这些结果表明，OTUD7B的表达缺失是肾纤维化过程中的一个普遍事件。
过表达OTUD7B在体内外缓解肾纤维化
为探究OTUD7B的功能，研究者在HK-2细胞中过表达OTUD7B，发现其可显著减轻TGF-β诱导的胶原蛋白I/III和α-SMA的上调。同样，通过AAV9病毒在小鼠体内过表达OTUD7B，也能有效改善UUO和I/R模型引起的肾组织病理损伤、胶原沉积和纤维化标志物升高。这证明OTUD7B具有抑制肾纤维化的功能。
敲低OTUD7B在体内外加剧肾纤维化
反之，在细胞中敲低OTUD7B，会加剧TGF-β诱导的纤维化标志物表达。在动物模型中，通过AAV9-shRNA系统性敲低或利用肾小管特异性敲除小鼠，均发现OTUD7B的缺失会进一步恶化UUO和I/R诱导的肾纤维化程度。这从反面证实了OTUD7B是肾纤维化的一个关键抑制因子。
OTUD7B靶向PRDX1调控肾纤维化
为阐明机制，研究者通过免疫沉淀-质谱联用技术筛选OTUD7B的相互作用蛋白，并将目标锁定在抗氧化酶PRDX1上。Co-IP、GST pull-down及结构域映射实验证实，OTUD7B通过其OTU结构域与PRDX1的1-cysPrx_C结构域直接相互作用。
OTUD7B通过泛素-溶酶体途径抑制PRDX1降解的增强
机制深入研究发现，OTUD7B的敲低或过表达不影响PRDX1的mRNA水平，但显著调控其蛋白水平。蛋白质半衰期追踪实验表明，敲低OTUD7B会缩短PRDX1的蛋白半衰期。通过使用溶酶体抑制剂（CQ、巴弗洛霉素A1）和蛋白酶体抑制剂（MG132）处理，证实PRDX1主要通过溶酶体途径降解，而OTUD7B正通过抑制此途径来稳定PRDX1。进一步的泛素化分析揭示，OTUD7B能够特异性去除PRDX1上K63连接类型的泛素链，且主要作用位点是PRDX1蛋白的第185位赖氨酸（K185）。挽救实验表明，过表达PRDX1可以逆转因OTUD7B敲低导致的纤维化加剧，证明了OTUD7B的抗纤维化作用依赖于PRDX1。
OTUD7B和SMURF1平衡PRDX1泛素化水平
泛素化是E3泛素连接酶和DUB动态拮抗的过程。研究者通过数据库预测和IP实验，发现E3连接酶SMURF1能与PRDX1相互作用，并且也结合在PRDX1的1-cysPrx_C结构域。SMURF1在纤维化模型中表达上调，其敲低可增加PRDX1蛋白水平和稳定性。泛素化实验证明，SMURF1促进PRDX1发生K63连接类型的泛素化，修饰位点同样是K185。有趣的是，OTUD7B的过表达可以减弱SMURF1介导的PRDX1泛素化，并削弱SMURF1与PRDX1之间的相互作用。更重要的是，在同时敲低SMURF1的情况下，敲低OTUD7B不再导致PRDX1蛋白水平的下降。这表明OTUD7B与SMURF1竞争性结合PRDX1的相同结构域，OTUD7B通过物理性阻碍SMURF1对PRDX1的识别，从而保护PRDX1免于被K63泛素化标记并送往溶酶体降解。
过表达OTUD7B对肾纤维化的抑制作用依赖于PRDX1
最后，功能挽救实验在体内外证实了该轴线的必要性。在细胞或小鼠模型中，过表达OTUD7B带来的抗纤维化效果，可被同时敲低PRDX1所抵消；而若在此基础上进一步敲低SMURF1（即解除对PRDX1的降解压力），则抗纤维化效果得以重现。这强有力地证明，OTUD7B通过拮抗SMURF1、稳定PRDX1来发挥其缓解肾纤维化的功能。
研究结论与意义
该研究系统性地揭示了一条调控肾纤维化的新通路：在肾脏损伤向纤维化发展过程中，去泛素化酶OTUD7B表达下调，削弱了对E3泛素连接酶SMURF1的拮抗能力。SMURF1得以更多地促进抗氧化酶PRDX1发生K63连接类型的泛素化修饰，从而导致PRDX1通过溶酶体途径降解。PRDX1的耗竭削弱了细胞清除活性氧（ROS）的能力，加剧氧化应激，从而促进纤维化信号通路的激活和细胞外基质的异常沉积。反之，增强OTUD7B的功能则可打破这一恶性循环。
这项研究的创新性与重要意义在于：首先，它首次报道了OTUD7B在肾纤维化中的保护作用及其具体分子机制，填补了该领域空白。其次，它阐明了泛素化修饰中“写入者”（E3连接酶SMURF1）与“擦除者”（DUB OTUD7B）如何通过动态拮抗，精细调控关键蛋白（PRDX1）稳定性的新范例，深化了对泛素化平衡在纤维化中作用的理解。最后，也是最具有转化潜力的一点，该研究鉴定出的“OTUD7B-SMURF1-PRDX1”轴，为开发治疗肾纤维化乃至其他器官纤维化的新型药物提供了多个潜在的干预靶点。例如，开发OTUD7B激动剂、SMURF1抑制剂或PRDX1稳定剂，都可能成为延缓甚至逆转肾纤维化进程的新策略。
