《Journal of Chromatography A》：Characterization of siRNA Product-Related Impurities by Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography (HILIC) Coupled with Mass Spectrometry
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HILIC-MS方法被用于评估治疗性寡核苷酸中部分磷硫代修饰的siRNA双链 antisense链与parent FLP的分离效果，同时比较了IP-RPLC-MS和AEX-LC的分离性能。结果显示HILIC-MS在区分GalNAc簇相关杂质（如未完全连接的支链）和完整产物方面具有正交性优势，且与IP-RPLC-MS的分离机制互补。
Micaela Graglia | Sean Brian Yeldell | Nadeschda Demtschenko | Lucas Bethge
Silence Therapeutics AG, 柏林, 德国
摘要
治疗性寡核苷酸的质量控制主要通过离子对反相液相色谱（IP-RPLC）与质谱联用以及阴离子交换液相色谱来实现。随着临床开发过程中制造要求的提高，对从全长产物中分离杂质的需求也在增加。因此，需要更多种类的分析方法来处理治疗性寡核苷酸。亲水相互作用液相色谱（HILIC）作为一种正交分析方法正在逐渐兴起。我们介绍了一种超高效液相色谱-质谱联用的HILIC方法，该方法能够有效分离修饰RNA中的截断杂质。我们以一个实例展示了该方法的应用：该实例中使用的部分磷硫酰化的单链用于构建GalNAc偶联的双链siRNA。无论是由于序列中的不完全偶联还是由于GalNAc簇（由分支剂和GalNAc磷酸酰胺连续偶联而成）的不完全偶联，截断杂质都能与其母体FLP有效分离。实验结果证明了HILIC与IP-RPLC在分离GalNAc簇相关杂质方面的可比性以及HILIC相对于IP-RPLC的正交性。
引言
人们对小干扰RNA（siRNA）疗法的兴趣日益增加，不仅适用于罕见疾病，也适用于更常见的疾病，这导致临床试验中涉及的分子数量不断增加，从而迫切需要更准确地表征siRNA杂质。正如欧洲药品管理局（EMA）发布的《寡核苷酸开发和制造指南》草案所指出的，这种需求推动了更多正交分析方法的发展。
目前，治疗性寡核苷酸（ONs）的质量控制主要通过离子对反相液相色谱与质谱联用（IP-RPLC-MS）和阴离子交换液相色谱（AEX-LC）来实现[2,3]。在IP-RPLC中，分离机制受ON的电荷、IP试剂的性质以及核碱基的疏水性影响[4]。IP-RP保留作用的主要机制有两种：1）ON上的负电荷磷酸键与流动相中的正电荷烷基铵离子形成中性离子对，这种中性复合物与固定相发生疏水相互作用；2）IP试剂因其疏水性而被吸附在固定相上，从而在固定相表面形成正电荷离子，进而与ON上的负电荷磷酸基团发生静电相互作用。随着有机溶剂比例的增加，IP试剂-分析物复合物会被洗脱[5]。IP-RPLC-MS主要用于ON序列及其杂质的鉴定和定量。文献中有多项研究探讨了离子对试剂、流动相组成和柱温对ON及其磷硫酰化衍生物分离的影响[6, [7], [8]。AEX-LC是第二种常用的ON表征色谱技术，主要用于确定ON的纯度。但由于流动相中盐分浓度较高，AEX-LC不适用于质谱分析，因此在缺乏参考标记物的情况下无法用于分析物鉴定。在强阴离子交换色谱条件下，分离主要基于固定相上的正季胺离子与ON负电荷之间的静电相互作用；分析过程中盐浓度的增加会影响分析物从柱子中的释放情况，较长链的ON在柱子上的保留时间更长[4,9,10]。
在siRNA疗法的开发过程中，人们对天然RNA进行了多种修饰，以提高分子的总体稳定性、特异性和效力，并减少脱靶效应和毒性[11]。例如，在核糖的2′-羟基引入甲氧基（2′-O-甲基）和氟（2′-氟）取代基以增强抗核酸酶能力[12]；同时，部分磷酸二酯键被替换为磷硫酰（PS）或磷二硫酯（PS2）键[13]；引入锁定核酸（LNA）结构以提高siRNA在血清中的稳定性[15]，以及糖醇核酸（GNA）以减少脱靶效应[16]。此外，siRNA正义链可以与不同的靶向配体结合，如N-乙酰半乳糖胺（GalNAc），以实现肝脏靶向递送[17, [18], [19]。虽然这些结构修饰可以提升生物活性和稳定性，但某些修饰可能会在固相合成和后续处理过程中产生副产物（如脱氟、PS转化为PO）。Pourshahian[3]总结了多种与产品相关的副产物。Capaldi等人[20]根据结构将固相合成过程中产生的主要杂质分为四类：主要代谢物（I类）、与天然核酸相关的杂质（II类）、原始序列的变异体（III类）以及含有非天然核酸成分的杂质（IV类）。基于这一分类，我们重点研究了属于前三类的杂质的分离方法，因为这些杂质在各种治疗性寡核苷酸平台中普遍存在，且可以系统地合成用于早期分析方法开发。为此，我们探讨了亲水相互作用液相色谱与质谱联用（HILIC-MS）在表征具有天然磷酸二酯骨架和部分磷硫酰化ONs中的应用。HILIC是一种用于极性分子在极性固定相上分离的色谱技术，采用高有机溶剂作为流动相，无需昂贵的或有毒的离子对添加剂[21,22]。HILIC首次应用于ONs的研究可追溯到1990年的Alpert[23]，他提出分离机制主要是分析物在固定相上的水富集层与疏水流动相之间的分配。后续研究显示HILIC的分离机制还涉及氢键、偶极-偶极和静电相互作用[24,25]。过去15年中，HILIC作为IP-RP和AEX液相色谱的正交方法得到了广泛研究[26]，并测试了多种色谱柱[28], [29], [30], [31], [32]，评估了柱温、流动相组成、盐分和pH值的影响[31], [32], [33], [34], [35]，还研究了含有磷硫酰化和LNA等修饰的ONs的分离效果[29]。
在这项研究中，我们首先评估了HILIC-MS与IP-RP-LCMS和AEX-LC在分离具有类似siRNA反义链修饰模式（核糖2′-羟基上的OMe和F交替）的寡核苷酸时的性能，使用了具有相同序列但长度不同的ON混合物。接着，我们测试了这三种色谱技术在分离部分磷硫酰化反义链和部分磷硫酰化正义链与其相应全长产物（FLPs）相关杂质方面的正交性。最后，我们使用HILIC成功分离出了与GalNAc相关的杂质，据我们所知，这一结果尚未在文献中报道。
化学试剂与材料
所有溶剂和添加剂均为LC-MS级别。乙腈和甲醇购自Chemsolute；99.5%丁胺、99%己胺、≥99.0%乙酸铵和1M Trizma盐酸溶液购自Sigma Aldrich；99% 2-六氟-2-丙醇购自ChemPUR；99%甲酸、99%乙酸和HPLC级三乙胺购自Carlo Erba；98%高氯酸锂购自Thermo (Alfa Aesar)。
分析的寡核苷酸及样品制备
所有样品均按标准方法制备。
方法开发
开发HILIC-MS分析方法的目标是从全长产物（FLP）中分离杂质并通过质谱解卷积进行鉴定。为了证明该方法与IP-RP-LCMS和AEX-LC的正交性，特别需要分离那些难以通过这两种方法分离的杂质[27]。
UV色谱方法应具备高于2.0的峰分辨率（Rs）和5%下的峰对称性（USP尾峰因子）。
结论
本研究比较了IP-RP-LCMS和AEX-LC与HILIC-MS三种方法在分离部分磷硫酰化和非磷硫酰化寡核苷酸序列及其杂质方面的性能。结果显示，三种方法均能成功分离出具有天然磷酸二酯骨架并在2′位置交替引入OMe和F的19聚体及其对应的短链（n-X）和长链（n+X）。
CRediT作者贡献声明
Micaela Graglia：撰写初稿、验证、方法学设计、数据整理、概念构建。
Sean Brian Yeldell：撰写与编辑、撰写初稿、方法学设计。
Nadeschda Demtschenko：撰写初稿、验证、实验设计。
Lucas Bethge：撰写与编辑、撰写初稿、指导工作、方法学设计、概念构建。
