《Journal of Chromatography A》：A Comprehensive Review of Advances in Analytical Chromatography for the Characterization of Therapeutic Biomacromolecule and Bioparticle
编辑推荐：
生物大分子与生物粒子的高效分离及质谱联用技术进展，涵盖尺寸排阻、离子交换等色谱模式的创新应用及检测策略优化，为新型药物制剂的质量表征提供决策依据。
作者：Navratan Soni, Mukul Yadav, David Paul
印度西孟加拉邦加尔各答国家制药教育与研究学院（NIPER）制药分析系，邮编700114
摘要
治疗性生物大分子和生物颗粒（如单克隆抗体、核酸治疗剂、病毒载体、脂质纳米颗粒和细胞外囊泡）的迅速发展，迫切需要先进的分析技术和色谱方法来解析其结构、组成和物理化学异质性。传统的分析方法往往无法充分表征这些复杂系统中的重要质量属性，例如尺寸和电荷变体、翻译后修饰、构象完整性和颗粒级别的异质性等。本文综述了一些现代分析色谱方法在分离和表征这些复杂生物系统方面的最新进展，这些方法结合了质谱、多角度光散射和离子迁移谱等高端检测技术。文章重点讨论了尺寸排阻色谱、离子交换色谱、疏水相互作用色谱、亲水相互作用色谱、反相色谱、亲和色谱和流场分馏色谱的关键发展，并提供了比较分析，以突出每种技术对不同类型生物分子的适用性、局限性和分析能力。总体而言，本文旨在为科学家和工业从业者提供决策指导，帮助他们选择合适的分析色谱策略来表征新兴的治疗性生物大分子和生物颗粒。
引言
现代生物技术和制药科学的基础是由生物大分子和生物颗粒构成的，这些物质包含了一系列复杂的基于分子的实体。蛋白质、核酸、碳水化合物、脂质及其更复杂的组合（包括蛋白质聚集体、病毒载体、脂质纳米颗粒（LNPs）和细胞外囊泡（EVs）都属于这一范畴。这些超分子生物系统具有独特的物理化学特性，如较大的分子量、复杂的三维结构、决定其与色谱相相互作用的两亲性表面特性，以及在分析过程中必须保持的精细构象稳定性[1]。生物大分子在现代生物治疗设计中的广泛应用（无论是单克隆抗体（mAbs）还是抗体-药物偶联物（ADCs）、基因治疗、mRNA治疗还是基于蛋白质的疫苗）带来了新的分析挑战。因此，需要专门的分离和表征方法，在保持生物活性的同时提供全面的结构和功能信息[2]。当前生物制剂的复杂性远超传统药物分子，要求分析方法能够考虑关键的质量属性，包括蛋白质聚集状态、翻译后修饰（如糖基化和脱酰胺作用）、由于化学变化导致的电荷异质性、支持生物活性的构象完整性以及不同群体之间的组成异质性[[3], [4], [5], [6]]。此外，像LNPs、腺相关病毒载体（AAVs）和EVs这样的系统的开发，使其作为生物标志物或治疗载体，进一步增加了分析压力，将标准的生物分子表征数据扩展到更复杂的颗粒系统领域，从而需要专门的分离方法和检测策略。图1对多种技术的分离机制进行了分类[7,8]。
在这方面，色谱分离后结合质谱检测已成为当代生物制药表征的主要分析方法[9]。尽管传统的免疫测定和基于细胞的测定方法仍可用于测量效力和结合能力，但它们缺乏分子特异性，难以区分生物和制造基质中的完整生物分子、结构修饰变体、截短代谢物或偶联物种。交叉反应、基质干扰和较差的多重检测性能限制了基于抗体的测定在复杂生物制剂研究中的应用，使其不太适合全球范围内的分子谱型分析。相反，LC-MS和多维LC-MS工作流程可以直接且以结构分辨的方式识别完整的蛋白质、肽、核酸和纳米颗粒成分，允许在单次实验中识别、定量和表征多种分子形式。分子选择性对于解决糖型分布、氧化或脱酰胺形式变化、ADC中的药物与抗体比例以及病毒衣壳或脂质包裹核酸的完整性等问题至关重要[[10], [11], [12], [13]]。
色谱方法已成为分离和表征生物大分子和生物颗粒的主要且最可靠的分析平台。与其他分析策略相比，这种方法具有某些显著优势。所有色谱分离的基本原理是流动相和固定相中分析物浓度的不同，可以通过多种相互作用过程（如尺寸排阻效应、静电相互作用、疏水相互作用、生物特异性识别事件和流体力学效应）来选择性地分离复杂的生物分子混合物[[14], [15], [16]]。HPLC和UHPLC系统经历了持续的发展，以支持这些专门的分析需求，仪器硬件和软件功能也有了显著改进。这些发展使得根据具体分析需求实现高通量或超高分辨率的分离成为可能。色谱方法在生物制药应用中的重要性不仅体现在分离能力上，还体现在质量控制、过程开发和整个生物制药开发周期的基础研究中的关键作用[17]。色谱分析已成为当代生物制药生产中验证产品一致性、安全性和有效性的关键技术，通过表征关键质量属性来实现。全球监管机构认为色谱方法是提供分析可比性、支持产品许可申请以及确定开发和商业生产阶段产品稳定性的重要工具[18]。本文全面探讨了当前色谱技术的现状，涵盖了基本原理、最新技术进展以及各种色谱模式的应用，共同解决了现代生物系统的各种分析问题。讨论内容包括已知的生物分子分离方法和最近的生物颗粒表征方法，这些方法在现代应用中的选择、优化和实施至关重要。
章节摘录
生物大分子的分析色谱技术
色谱技术是用于生物大分子和生物颗粒分子表征的最通用和最广泛采用的分析工具。区分色谱仪器平台（如HPLC和UHPLC系统）和色谱分离模式（由固定相化学和分离机制定义，包括尺寸排阻、离子交换、疏水相互作用、亲水相互作用等）是必要的
流场色谱（HDC）
流场色谱已从一种简单的颗粒分离方法发展成为一种具有独特功能的复杂分析方法，可用于检测生物颗粒。该方法基于压力驱动的层流中的尺寸排阻效应进行分离，较大颗粒在通道壁附近的平均速度高于较小颗粒
生物大分子分析中的创新应用
对生物制药、先进治疗剂和基于纳米技术的递送系统的日益增长的需求，迫切需要开发多功能、高通量和高分辨率的色谱技术，以分离和表征这些复杂的生物化合物。生物大分子表现出结构异质性和动态变异性；这些技术利用了尺寸、电荷、疏水性、亲和力和立体化学等特性
未来展望与结论
色谱技术已从一种简单的分子分离方法发展成为一种既能揭示机制又能指导决策的生物大分子和生物颗粒表征平台。由于正交选择性（电荷、疏水性、亲和力、极性和尺寸）的结合以及固定相的改进，复杂实体（如单克隆抗体、ADCs、双特异性蛋白、寡核苷酸等）的结构异质性得到了显著提高
缩写
μPACs：微柱阵列柱；AAVs：腺相关病毒载体；ADCs：抗体-药物偶联物；AEX：阴离子交换色谱；AF4：非对称流场分馏；ATRP：原子转移自由基聚合；BaNC：裸窄毛细管HDC；BEH：乙烯桥接杂化柱；BsAbs：双特异性抗体；CD-MS：圆二色性-质谱；CEX：阳离子交换色谱；CEX-nMS：带原素质谱的阳离子交换色谱；CIM：对流色谱
CRediT作者贡献声明
Navratan Soni：撰写初稿、可视化、方法论设计、数据分析、概念构建。
Mukul Yadav：撰写初稿、可视化、方法论设计、数据分析、概念构建。
David Paul：审稿与编辑、监督、正式分析、概念构建。
