使用UPLC-MS/MS技术同时定量人血浆中的鞘脂代谢物

《Journal of Chromatography B》：Simultaneous quantification of sphingolipid metabolites in human plasma using UPLC-MS/MS

本研究采用UPLC-MS/MS法建立血浆中鞘脂类物质（SP、DSP、S1P）的同步定量分析方法，通过活性炭优化消除基质干扰。结果显示MAFLD患者血浆SP、DSP和S1P水平较健康对照组显著升高。

　　

孙培琪|杭飞|王嘉阳|姜宇然|潘凌云|胡成

上海中医药大学科学技术实验中心，中国上海201203

摘要

鞘氨醇（SP）、二氢鞘氨醇（DSP）和鞘氨醇1-磷酸（S1P）是鞘脂途径中的关键代谢物。它们在代谢相关性脂肪肝病（MAFLD）的发展过程中发挥着复杂多样的作用。在这项研究中，我们开发了一种高度敏感和特异的分析方法，利用超高效液相色谱（UPLC）与串联质谱（MS/MS）技术同时定量这三种鞘脂。通过优化的活性炭处理生成了脱除生物基质的样本，以促进更准确的校准。样品制备包括使用甲醇进行简单的蛋白质沉淀，随后浓缩上清液并在注射前重新配制。检测采用三重四极杆质谱仪的多反应监测模式进行。色谱分离在Waters ACQUITY UPLC HSS C₁₈柱上完成，采用梯度洗脱。D- erythro-sphingosine-d₇作为内标。新建立的方法在选择性、线性、准确性、精确度、回收率和稳定性方面符合公认标准。该技术有效应用于定量来自MAFLD患者（n = 30）和健康对照组（n = 30）的血浆样本中的三种鞘脂代谢物。数据分析显示，MAFLD患者的SP、DSP和S1P水平显著高于健康受试者。

引言

代谢相关性脂肪肝病（MAFLD）是一种临床和病理状况，其特征是在不大量饮酒且没有可识别遗传疾病的个体中肝脏内脂质异常积累。这种情况表明肝脏对营养过剩的反应，包括从单纯的脂肪变性（称为代谢相关脂肪肝，MAFL）到代谢性脂肪性肝炎（MASH）等一系列疾病，后者有可能发展为纤维化、肝硬化或肝细胞癌（HCC）[1]，[2]。其发病机制涉及氧化应激、炎症、DNA损伤和自噬功能障碍，导致肝脏和全身代谢紊乱[3]，[4]。MAFLD与代谢综合征的成分密切相关，包括肥胖、糖尿病、血脂异常和高血压，目前全球约有25%的成年人受到影响[5]，[6]。

鞘脂（SLs）是一类结构和信号传导脂质，对正常生理、细胞信号传导和营养支持至关重要[7]，[8]。越来越多的证据表明，鞘脂在线粒体膜中高度富集，并与多种线粒体蛋白相互作用，在调节线粒体形态、分布和功能中起关键作用。例如，鞘氨醇（SP）和鞘氨醇-1-磷酸（S1P）在控制细胞凋亡、炎症和细胞应激反应的途径中充当核心介质[9]。鞘脂代谢的失调会损害细胞功能和生物能量代谢，并干扰信号转导，不仅会导致代谢性疾病如MAFLD，还会导致癌症、心血管疾病和神经退行性疾病[10]。

鞘脂是一类以长链碱基为特征的脂质，包括SP和二氢鞘氨醇（DSP）。虽然SP是S1P的前体，但这两种分子具有不同的生物学作用；具体来说，SP具有抗增殖和促凋亡的特性，而S1P则促进细胞生长并增强存活能力[11]，[12]。S1P的信号机制已被深入研究，特别是作为S1P受体1（S1PR1）的细胞外配体，这与肿瘤发生和免疫系统调节有关[13]。此外，最新研究发现S1P在肝缺血后对肾组织具有保护作用[14]。

鉴于鞘脂的多种生物学作用及其结构间的相互转化，在血浆和组织中敏感准确地定量这些生物分子至关重要。早期的检测方法依赖于脱酰化后的紫外或荧光分析（对于复杂的鞘脂）以及使用邻苯二甲醛等发色团的衍生化[15]，[16]。蒸发光散射检测（ELSD）[17]消除了衍生化的需要，但在效率和简便性方面仍有局限。

与LC–ELSD相比，液相色谱结合串联质谱（LC–MS/MS）具有许多优势。独特的起始离子和产物离子组合允许即使在不同物种共洗脱的情况下也能进行精确鉴定和定量。LC–MS/MS能够对复杂混合物进行高精度分析，内标可以校正离子化变异性。目前，鞘脂定量通常纳入脂质组学研究[18]，[19]，[20]，适用于大规模、高通量分析和探索性研究。然而，现有的定量方法存在局限性：标准曲线通常是在基于酒精的溶剂中建立的，而不是在生物基质中建立的，忽略了基质效应[21]，[22]，目标化合物的早期洗脱可能导致与基质干扰的共洗脱和峰形不佳，影响峰面积积分[23]。我们系统地比较了五种先前发表的LC–MS/MS方法用于鞘脂分析，详细信息总结在表1中。

在这项研究中，我们的目标是（1）使用活性炭优化去除血浆中的内源性鞘脂，以获得无背景干扰的空白血浆；（2）建立通用的提取方案并开发用于血浆鞘脂定量的LC–MS/MS方法；（3）应用该方法评估MAFLD患者与健康对照组血浆中三种鞘脂的变化。

材料与试剂

鞘氨醇（D421027，纯度：≥99.55%）购自上海阿拉丁生化科技有限公司。二氢鞘氨醇（860498P，纯度：≥99%）和鞘氨醇1-磷酸（26993–30-6，纯度：≥95%）购自Sigma-Aldrich，而鞘氨醇-d7（1246304–34-6，纯度：≥99%）购自MedChemExpress。这些参考标准品以及内标的化学结构如图1所示。HPLC级甲醇和乙腈由Merck提供

色谱分离的改进和MS/MS光谱参数的优化

在我们的研究中，我们通过探索多种柱型和流动相配方来优化色谱参数，以提高分析物的检测和分离效率，同时最小化分析时间。在评估了几种柱子选项后，特别是BEH C₁₈和HSS C₁₈，我们发现Waters ACQUITY UPLC HSS C₁₈（100 mm × 2.1 mm，1.8 μm）柱子在分离和峰形方面表现出最高的效率。此外，我们还研究了不同的流动相

讨论

在方法开发过程中，校准标准和质量控制样品应在与研究样品相同的生物基质中制备。然而，对于内源性鞘脂来说，获得真正的空白基质具有挑战性。尽管已有许多LC–MS/MS方法被验证用于鞘脂检测，但使用纯溶剂或替代基质常常会导致基质效应的差异，从而与在天然基质中建立的校准曲线产生偏差[26]。

同位素标记的内标

结论

我们建立了一种LC-MS方法来测量人血浆中的内源性鞘脂（鞘氨醇、二氢鞘氨醇和鞘氨醇1-磷酸）。研究发现，MAFLD患者血浆中的这些内源性鞘脂含量显著高于健康对照组。

CRediT作者贡献声明

孙培琪：撰写——初稿、方法学、正式分析、概念构思。杭飞：方法学、数据管理。王嘉阳：软件、数据管理。姜宇然：可视化、正式分析。潘凌云：撰写——审阅与编辑、验证、监督。胡成：撰写——审阅与编辑、资源管理、项目协调、资金获取。

伦理批准和参与同意

该研究方案已获得医学伦理委员会（伦理批准编号PTEC-A-2023-10(S)-1）的批准。此外，所有参与者在参与研究前均提供了书面知情同意。

资助

本研究得到了国家自然科学基金（82474378）和上海市普陀区卫生健康系统科技创新重点项目（ptkwws202201）的资助。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。