《Journal of Genetics and Genomics》：The single cell transcriptomic landscape of recurrent giant cell tumor of bone following neoadjuvant denosumab therapy
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GCTB术后复发机制研究：单细胞测序揭示DMAb治疗后巨噬细胞分化及免疫抑制微环境促进复发，CSF1R抑制剂有效抑制复发肿瘤生长。
向林胡|华建吴|毕强郑|晁亮|柏冲石|庆荣叶|硕尔王|伟洛蔡|图胡|勇陈|莫成|王军严|文定黄
复旦大学上海癌症中心肌肉骨骼肿瘤科，中国上海200032
摘要
狄诺单抗（Denosumab，DMAb）被广泛用作新辅助疗法，用于降低骨巨细胞肿瘤（Giant Cell Tumor of Bone，GCTB）的临床分期。然而，越来越多的证据表明，新辅助DMAb治疗可能会增加GCTB刮除术后局部复发（Local Recurrence，LR）的风险。目前尚不清楚新辅助DMAb导致GCTB局部复发的潜在机制。在本研究中，我们对未经治疗的原发性GCTB、接受新辅助DMAb治疗的原发性GCTB以及刮除术后停止DMAb治疗并复发的GCTB进行了单细胞RNA测序。共获得了33,440个细胞样本。新辅助DMAb治疗后，原发性GCTB中的破骨细胞样巨细胞几乎消失，但在复发性GCTB中这些细胞会重新出现。新辅助DMAb治疗会诱导TNFSF11（RANKL）阳性的肿瘤细胞向SPP1（骨桥蛋白）阳性和CA2阳性的肿瘤细胞转化。新辅助DMAb治疗还会在肿瘤内形成持久的免疫抑制环境，表现为调节性T细胞（Tregs）数量增加，而细胞毒性CD8+ T细胞和自然杀伤T细胞（NKT细胞）数量减少。此外，DMAb诱导单核细胞分化为Trem2+巨噬细胞，这种微环境有利于肿瘤复发。CSF1R抑制剂可以抑制复发性GCTB的生长。针对CSF1R并缓解T细胞耗竭可能为DMAb治疗后的GCTB复发管理提供新的治疗思路。
引言
骨巨细胞肿瘤（GCTB）是一种生物学行为中等的罕见原发性骨肿瘤。据报道，GCTB的年发病率约为每百万人1.3至1.7例，远低于骨肉瘤的发病率（Rockberg等人，2015年；Verschoor等人，2018年）。GCTB患者通常年龄在20至50岁之间，这一年龄段正是劳动年龄人口的主要组成部分。GCTB不应被视为良性肿瘤，因为它具有局部侵袭性、恶性潜能以及术后高复发率的特点。GCTB起源于骨髓中的未分化间充质基质细胞。肿瘤细胞是表达核因子κB受体激活因子（RANKL）配体（TNFSF11基因编码）的单核基质细胞。多核破骨细胞样巨细胞分布在肿瘤细胞周围，并表达RANK受体。这些巨细胞在肿瘤微环境中被招募并重新激活，导致骨溶解性病变、皮质骨破坏及周围软组织的侵袭。GCTB患者常伴有局部疼痛和病理性骨折，并有恶性转化和肺转移的风险（Tsukamoto等人，2019年；Hu等人，2022年；Johan等人，2022年；Tsukamoto等人，2022年）。
手术（包括刮除术和广泛切除术）仍是GCTB的主要治疗方法（Lipplaa等人，2019年；van der Heijden等人，2020年；Parmeggiani等人，2021年）。对于无法手术切除或手术并发症风险较高的GCTB患者，通常会在术前使用狄诺单抗（DMAb）来控制或降低肿瘤分期，从而减少手术的并发症。DMAb是一种单克隆抗体，它通过特异性阻止RANKL与破骨细胞样巨细胞上的RANK结合来抑制破骨细胞活性和随后的骨吸收（Palmerini等人，2017年；Medellin等人，2018年；Rutkowski等人，2018年；Chawla等人，2019年；Raimondi等人，2020年；Borkowska等人，2022年；Tan等人，2023年）。
然而，越来越多的高质量临床证据表明，新辅助DMAb治疗可能会增加GCTB刮除术后的复发风险（Errani等人，2018年；Chinder等人，2019年；Sano等人，2020年；Tsukamoto等人，2020b年；Sun等人，2023年）。一项系统性回顾显示，仅接受刮除术的患者的复发率为0%至50%，而接受新辅助DMAb治疗后再进行刮除术的患者的复发率则上升至20%–100%（Tsukamoto等人，2020a年）。仅接受刮除术的患者3年无复发生存率约为79.9%，而接受新辅助DMAb治疗后再进行刮除术的患者这一比率降至35.3%（Asano等人，2022年）。一项大型荟萃分析进一步指出，新辅助DMAb治疗后的复发风险几乎是仅接受刮除术的患者的三倍（Zhao等人，2021年）。此外，一些病例报告表明DMAb治疗可能促进GCTB的恶性肉瘤化（Alaqaili等人，2018年；Vari等人，2022年）。尽管如此，目前对新辅助DMAb如何导致GCTB术后复发的潜在生物学机制仍知之甚少。
单细胞RNA测序（scRNA-seq）是解析肿瘤进展、复发、肿瘤生物学关键方面以及抗肿瘤治疗期间分子信号事件的强大工具（Lei等人，2021年；Ren等人，2021年）。迄今为止，仅有三项研究使用scRNA-seq分析了GCTB的细胞特征，但这些研究都仅基于一到两个样本。然而，没有一项研究利用scRNA-seq来阐明新辅助DMAb治疗和刮除术后复发的机制（Feng等人，2021年；van IJzendoorn等人，2022年；Yang等人，2022年）。在本研究中，我们收集了涵盖整个疾病进程的GCTB组织样本——从未经治疗的肿瘤到接受新辅助DMAb治疗的肿瘤，再到刮除术后停止DMAb治疗并复发的病灶。我们的目标是通过scRNA-seq探究新辅助DMAb促进GCTB复发的潜在生物学机制。
不同DMAb治疗条件下GCTB的细胞组成
我们对四个GCTB肿瘤样本和一个肿瘤旁松质骨样本进行了scRNA-seq分析，以研究不同DMAb治疗条件下的细胞多样性和肿瘤微环境。四个GCTB肿瘤样本中，一个来自未经治疗的原发性GCTB，两个来自接受新辅助DMAb治疗的原发性GCTB，另一个来自刮除术后停止DMAb治疗并复发的GCTB（图1A）。患者的临床和病理特征如下
讨论
作为RANKL的特异性抑制剂，DMAb通过消除GCTB中的破骨细胞样巨细胞来抑制骨溶解性破坏。然而，它并未减少基质肿瘤细胞的数量，甚至可能诱导肿瘤亚型之间的表型转化。Venneker及其同事（Venneker等人，2022年）通过组织形态测量分析发现，DMAb治疗减少了GCTB中的细胞总数，这与我们在scRNA水平上的观察结果一致。我们进一步证实了这一点
用于scRNA-seq的患者样本
2023年，我们从复旦大学上海癌症中心的四名GCTB患者身上收集了五个组织样本进行scRNA-seq分析。所有患者均通过放射影像学检查、组织病理学染色以及H3F3A基因突变确认诊断为GCTB。本研究已获得复旦大学上海癌症中心伦理委员会的批准（批准编号2508-Exp254）。所有患者均签署了书面知情同意书。患者1
CRediT作者贡献声明
庆荣叶：数据可视化、验证、软件使用、资源管理、方法设计、实验设计、数据分析、数据整理。
柏冲石：数据可视化、验证、监督、软件使用、资源管理、项目协调、方法设计、实验设计、数据分析、数据整理。
晁亮：初稿撰写、数据可视化、验证、软件使用、资源管理、项目协调、方法设计、实验设计、数据分析、数据整理。
毕强郑：数据可视化、验证、监督、实验设计、数据分析
数据可用性
本研究的scRNA-seq原始数据已存储在中国国家生物信息中心的Big Sub数据库中（HRA016527）。
利益冲突
作者声明没有利益冲突。
致谢
作者衷心感谢OE Biotech有限公司（中国上海）提供单细胞RNA测序服务。本研究得到了国家自然科学基金（项目编号81872179）的支持。
